Regulación de la estabilidad, localización subcelular y actividad transcripcional de la map qunasa ERK5 por las chaperonas hsp90 y Cdc37. rol de erk5 en cancer de prostata

Author

Erazo Andrade, Ingrid Tatiana

Director

Lizcano de Vega, José Miguel

Codirector

Gómez Trias, Néstor

Date of defense

2013-07-18

ISBN

9788449042553

Legal Deposit

B-7458-2014

Pages

215 p.



Department/Institute

Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular

Abstract

La vía de señalización celular MEK5-ERK5 se activa en respuesta a un amplio rango de factores de crecimiento y diferentes tipos de estrés. Fosforila los factores de transcripción de la familia MEF2 y juega un relevante papel en el control de la proliferación celular inducida por factores como el EGF, además de controlar la supervivencia celular y la angiogénesis. ERK5 difiere estructuralmente de otras MAP quinasas en presentar una larga y única cola C-terminal. Esta cola tiene un efecto autoinhibitorio sobre la actividad quinasa y presenta un motivo de localización nuclear NLS (sólo accesible en la conformación activa/abierta de la quinasa), además de un dominio de activación transcripcional que interacciona con MEF2D y potencia la actividad transactivadora del factor de transcripción AP-1. Así, ERK5 activa la transcripción de ciertos genes no sólo por la fosforilación directa de factores de transcripción, sino también actuando como coactivador transcripcional de, por ejemplo, el factor AP-1. Previamente en nuestro laboratorio, utilizando la técnica del Tandem Affinity Purification (TAP), se identificó a la chaperona Hsp90β como una putativa proteína que interacciona con ERK5. En este trabajo, mediante ensayos de co-inmunoprecipitación de las proteínas endógenas y sobre-expresadas, demostramos que ERK5 forma un complejo trimérico con las chaperonas Hsp90β y Cdc37, y que la inhibición farmacológica de Hsp90β o Cdc37 induce la ubiquitinación y degradación proteosomal de ERK5. Estos resultados proponen a ERK5 como una nueva proteína cliente de la chaperonas Hsp90/Cdc37, necesarias para el correcto plegamiento y mantenimiento de la estructura de la quinasa. Por primera vez se muestra que la activación canónica de ERK5 (por MEK5) induce la disociación de Hsp90 del complejo ERK5-Cdc37, como paso previo a la translocación nuclear de ERK5 y la consiguiente activación de la transcripción, por un mecanismo que requiere la autofosforilación de la cola C-terminal de la quinasa. Por otra parte, se ha establecido que la expresión de Cdc37 en exceso (como ocurre en algunos tipos de cáncer) promueve la disociación de Hsp90 del complejo y la translocación nuclear de una forma inactiva de ERK5 capaz de potenciar la actividad transcripcional del factor AP-1. Este resultado constituye la primera evidencia de un mecanismo no canónico de translocación que implica la entrada en el núcleo de una ERK5 inactiva que retiene la capacidad de activar la transcripción mediada por el factor AP-1. También se propone a Hsp90 como una proteína que serviría de anclaje citosólico de ERK5. Por otra parte, se han obtenido evidencias que muestran que tanto la activación canónica (MEK5) como no canónica (Cdc37) inducen la SUMOilación de ERK5 en el extremo N-terminal de la proteína. Mediante ensayos bioquímicos y de inmunofluorescencia aportamos evidencias que apuntan a que tanto la disociación de Hsp90 como la SUMOliación son eventos necesarios pero no suficientes per se para que ocurra la translocación nuclear de ERK5. Se han generado líneas celulares que sobre-expresan establemente ERK5 y/o Cdc37, que muestran que ambas proteínas cooperan en promover un drástico incremento en la proliferación y la migración celular. Este resultado es relevante dado que la sobreexpresión de ERK5 como Cdc37 son eventos que ocurren en ciertos tipos de cáncer, como el adenocarcinoma prostático. Por último, mostramos que ERK5 interacciona con el receptor de andrógenos (AR) en el citosol de las células en reposo, y que la activación de este receptor con ligandos induce la translocación de AR y ERK5 inactiva al núcleo, donde siguen interaccionando y colaboran en la promoción de la actividad transcripcional del AR sobre la proteína antígeno prostático (PSA, biomarcador clínico especifico del cáncer de próstata). Se ha observado otro link funcional entre ambas proteínas, ya que la activación de ERK5 por MEK5 o la sobre-expresión de Cdc37 incrementan la actividad ligandodependiente del receptor de andrógenos, mientras que el silenciamiento de la ERK5 celular bloquea dicha activación transcripcional.


The MEK5-ERK5 signaling pathway is activated in response to growth factors and different forms of stress. ERK5 phosphorylates the transcription factors, members of the myocyte enhancer factor family, MEF2 and plays an important role in the control of cell proliferation induced by factors such as EGF, as well as control of cell survival and angiogenesis. In contrast with other MAPKs, ERK5 has a unique C-terminal tail. This domain auto-inhibits the kinase activity and has a nuclear localization signal (NLS) (only available in the active/open conformation), moreover contains a transcriptional activation domain that interacts with MEF2D and enhances the activity of the AP-1 transcriptional complex. Thus, ERK5 is able to activate transcription not only by direct phosphorylation of transcription factors but by acting itself as a transcriptional coactivator, as, for example, in the case for the activator protein 1 (AP-1) transcription factor. Previously in our laboratory using the technique of Tandem Affinity Purification (TAP), we identified the chaperone Hsp90β as a putative interacting protein ERK5. In this study, using co-immunoprecipitation assays of endogenous and recombinant proteins, we demonstrated that ERK5 forms a trimeric complex with Hsp90β and Cdc37, and the pharmacological inhibition of Hsp90 and Cdc37 induces ubiquitination of ERK5 prior to degradation at the proteasome. These results suggest that ERK5 is a novel client protein of the chaperone Hsp90/Cdc37, and these chaperones are necessary to maintain the proper folding and structure of the kinase. For the first time we show that the canonical activation of ERK5 (by MEK5) induces the Hsp90 dissociation from the ERK5-Cdc37 complex, leading to ERK5 nuclear translocation and activation of transcription, by a mechanism which requires the autophosphorylation at its C-terminal tail. Moreover, the overexpression of Cdc37 (as in some types of cancer) promotes Hsp90 dissociation and the nuclear translocation of a kinase-inactive form of ERK5 which retains transcriptional activity. This is the first example showing that ERK5 transcriptional activity does not require kinase activity. We propose that Hsp90 might be the cytosolic anchor of ERK5. Moreover, we show that both the canonical activation canonical (MEK5) as noncanonical (Cdc37) induce the ERK5 SUMOylation at its Nterminal half. The biochemical and immunofluorescence assays provided evidence that both the Hsp90 dissociation as the ERK5 SUMOylation are necessary but not sufficient per se to induce ERK5 nuclear translocation. We generated stable cell lines that over-express ERK5 and/or Cdc37, we showed that both proteins cooperate to promote a dramatic increase in cell proliferation and migration. This result is important because overexpession of ERK5 and Cdc37 are events that occur in certain types of cancer, including prostate adenocarcinoma. Finally, we show that ERK5 interacts with the androgen receptor (AR) in the cytosol of resting cells, and that activation of this receptor with ligands induces the nuclear translocation of AR and inactive ERK5, and in this cellular compartment they continue interacting and promoting the transcriptional activity of AR through PSA (PSA specific clinical biomarker for prostate cancer). It has been observed another functional link between these proteins, and that activation of ERK5 by MEK5 or overexpression of Cdc37 increase ligand-dependent activity of the androgen receptor, whereas the silencing of ERK5 inhibits this transcriptional activation.

Keywords

ERK5 cáncer; HsP90; Cdc37

Subjects

577 - Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics

Knowledge Area

Ciències Experimentals

Documents

itea1de1.pdf

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