Androgen receptor aggregates studies in vitro and in a transgenic mouse model of Spinal Bulbal Muscular Atrophpy (SMBA)

Abstract

Spinal bulbar muscular atrophy (SBMA) is a rare hereditary neuromuscular disease caused by the elongation of a polymorphic polyglutamine (polyQ) tract in the N-terminal region of the transactivation domain (NTD) of androgen receptor (AR). Although the molecular basis of SBMA is not yet fully understood, the observation of nuclear inclusions containing AR fragments in specific tissues of SBMA patients has led to the suggestion that it is linked to AR aggregation. To characterize the molecular mechanism of this process we have investigated the structural properties of the polyQ tract present in AR as well as the early stages of its oligomerization in vitro by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in solution.

To study the structural property of the AR aggregates in tissue, the Seprion ligand was used for quantification of AR aggregate load in a SBMA mouse model. A combination of atomic force microscopy (AFM), transmission electron microscopy (TEM) and high-resolution microscopy was used to investigate the Seprion ligand captured aggregates from muscle and spinal cord tissue. The results indicated that aggregated structures from spinal cord extract differ remarkably from the fibrillar species isolated from muscle tissue. We found that the AR fibrils in the muscles accumulate and increase their length as the animals age.

Our results indicate that there are differences between the androgen receptor variants in muscle and spinal cord, with more N-terminally truncated AR found in muscle compared to spinal cord. We propose that truncated AR forms aggregates and leads to AR fibrillar species in muscles and that mutant AR97Q plays a role in the recruitment of partner interacting proteins in an age-related fashion.

Our studies into the elucidation of the early stages of oligomerization indicated that the polyQ tract is partially alpha-helical, a propensity that increases with its length. In addition, a specific region of the N-terminus of the NTD, distinct from the polyQ tract, appears to be responsible for the inter-molecular interactions that nucleate AR aggregation.

Studying the interactions between AR and the molecular chaperones Hsp40 and Hsp72 respectively, by solution NMR spectroscopy we found that the Hsp72 and Hsp40 both bind to (23)FQNLF(27) motif, whereas the Hsp40 binds additionally to (54)LLLQQQQ(61). These findings provide a simple mechanism for the disassembly of the complex between AR and molecular chaperones required for androgen receptor function and emphasize the therapeutic potential of allosteric regulators of Hsp72 and Hsp40 and provide new insights into the role of the chaperone machinery in protein quality control in neurodegenerative diseases.

L'atròfia muscular espinobulbar (SBMA) és una malaltia neuromuscular hereditària causada per una elongació d'una regió de poliglutamines localitzada en el domini de transactivació del receptor d'andrògens (AR). Malgrat que la base molecular d'aquesta malaltia encara no es coneix del tot, l'observació d'inclusions nuclears que contenen fragments del receptor dóna suport a la hipòtesi que està associada a l'agregació de l'AR. Per tal de caracteritzar el mecanisme molecular d'aquest procés hem investigat les propietats estructurals de la regió de poliglutamines del receptor així com els primers estadis de la seva oligomerització in vitro mitjançant espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (NMR) en solució.

Per tal d'estudiar les propietats estructurals dels agregats que es formen en els teixits hem fet servir el lligand Seprion per aïllar els agregats que es formen en un model animal de SBMA. Mitjançant una combinació de microscòpia de força atòmica (AFM), microscòpia electrònica de transmissió (TEM) i microscòpia d'alta resolució hem caracteritzat els agregats formats tant en el múscul com en la medul·la espinal en aquest model animal. Els resultats indiquen que els agregats de l'AR que es formen en el múscul son clarament diferents d'aquells que es formen en la medul·la i, a més, que el fenotip dels animals empitjora a mesura que s'acumulen agregats en el primer d'aquests teixits.

Els nostres resultats indiquen que les diferències que observem entre els agregats que es formen en el múscul i aquells que es formen en la medul·la estan associades a la presència de fragments d'AR en el primer d'aquest teixits. Proposem doncs, que formes truncades d'AR agreguen per formar espècies fibril·lars en el múscul del model animal i que aquestes provoquen el fenotip, que empitjora amb l'edat, perquè, en agregar, recluten proteïnes nuclears que altrament serien solubles.

El nostre estudi dels primers estadis del mecanisme d'oligomerització indica clarament que la regió de poliglutamines és parcialment helicoïdal i que aquesta propensitat augmenta amb la seva longitud. A més hem identificat una regió del domini de transactivació, allunyada de la regió de poliglutamines, com a responsable de les primeres interaccions intermoleculars que tenen lloc durant el mecanisme d'oligomerització.

En el nostre estudi de la interacció entre AR i les xaperones moleculars Hsp40 i Hsp72 hem descobert, mitjançant NMR, que totes dues proteïnes s'uneixen al motiu (23)FQNLF(27) del domini N-terminal i que l'Hsp40 s'uneix, a la vegada també al motiu (54)LLLLQQQQ(61) que hi ha a l'inici de la regió de poliglutamines. Aquestes descobertes suggereixen un senzill mecanisme per a desensamblatge del complex entre l'AR i les xaperones moleculars que té lloc durant l'activació del receptor per l'hormona testosterona, emfatitzen el potencial terapèutic de reguladors al·lostèrics de Hsp40 i Hsp72 i contribueixen a una millor comprensió del paper que les xaperones moleculars tenen en el control de qualitat de proteïnes en malalties neurodegeneratives.