Glycosynthase Technology for Enzymatic Synthesis of Functionalized Artificial Polysaccharides as New Biomaterials

Author

Codera Pastor, Maria Victoria

Director

Planas Sauter, Antoni

Codirector

Faijes Simona, Magda

Date of defense

2015-07-17

Legal Deposit

B 20640-2015

Pages

258 p.



Department/Institute

Universitat Ramon Llull. IQS

Abstract

La tecnologia glicosintasa ha esdevingut una eina important per a la síntesi d’oligosacàrids, polisacàrids i glicoconjugats. Les glicosintases són glicosidases mutades desproveïdes d’activitat hidrolítica però capaces de catalitzar eficientment la formació d’enllaços glicosídics amb rendiments elevats en fer ús d’un donador glicosídic activat. A més a més, el donador activat i el seu producte de transglicosidació poden actuar com acceptors donant lloc a l’autocondensació del donador o a l’elongació del producte de transglicosidació, produint polisacàrids. En el present treball es pretén sintetitzar nous polisacàrids artificials funcionalitzats amb estructures definides mitjançant l’ús de la tecnologia glicosintasa. D’una banda, s’ha intentat augmentar la massa molecular dels polisacàrids fent ús d’un mòdul d’unió de carbohidrats (CBM). Aquest mòdul podria millorar la solubilitat dels nous polímers a mesura que es van sintetitzant durant la reacció de polimerització. L’efecte en el grau de polimerització ha estat estudiat tant pel mutant glicosintasa en presència de CBM com per la proteïna de fusió glicosintasa-CBM. D’altra banda, s’han sintetitzat polisacàrids artificials funcionalitzats a partir de donadors disacarídics activats on la funcionalització desitjada ha sigut prèviament introduïda a la posició C-6’. Aquests donadors funcionalitzats actuen com a substrat pel mutant glicosintasa que catalitzarà la reacció d’autocondensació. El grup azido va ser escollit com a un grup funcional adequat donada la seva versatilitat i mida, suficientment petit com per a ser acceptat per l’enzim. Els donadors fluorur de 6-azidolaminaribiosa i fluorur de 6-azidocel·lobiosa han estat sintetitzats i avaluats com a substrats per les reaccions glicosintasa amb el mutant E134S de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis i el mutant E197A de la cel·lulasa d’Humicola insolens, respectivament. S’han sintetitzat 6-azido i 6-amino-6-deoxicel·luloses artificials amb una seqüència de funcionalització alternada. De forma oposada a la modificació química de cel·luloses on la seqüència de substitució és intrínsecament aleatòria, la polimerització catalitzada per glicosintases de donadors glicosídics modificats apropiadament, permet accedir a noves cel·luloses funcionalitzades amb seqüències de substitució definides i regulars.


La tecnología glicosintasa se ha convertido en una herramienta importante para la síntesis de oligosacáridos, polisacáridos y glicoconjugados. Las glicosintasas son glicosidasas mutadas desprovistas de actividad hidroítica pero capaces de catalizar eficientemente la formación de enlaces glicosídicos con rendimientos elevados utilizando un dador glicosídico activado. Además, el dador activo y su producto de transglicosidación pueden actuar como aceptores dando lugar a la autocondensación del dador o a la elongación del producto de transglicosidación, produciendo polisacáridos. En el presente trabajo se pretenden sintetizar nuevos polisacáridos artificiales funcionalizados con estructuras definidas mediante el uso de la tecnología glicosintasa. Por un lado, se ha intentado aumentar la masa molecular de los polisacáridos utilizando un módulo de unión de carbohidratos (CBM). Este módulo podría mejorar la solubilidad de los nuevos polímeros a medida que se van sintetizando durante la reacción de polimerización. El efecto en el grado de polimerización ha sido estudiado tanto para el mutante glicosintasa en presencia de CBM como para la proteína de fusión glicosintasa-CBM. Por otro lado, se han sintetizado polisacáridos artificiales funcionalizados a partir de dadores disacarídicos activados donde la funcionalización deseada ha sido introducida previamente en la posición C-6’. Estos dadores funcionalizados actúan como sustrato para el mutante glicosintasa que catalizará la reacción de autocondensación. El grupo azido fue escogido por ser un grupo funcional adecuado dada su versatilidad y tamaño, suficientemente pequeño como para ser aceptado por el enzima. Los dadores fluoruro de 6-azidolaminaribiosa y fluoruro de 6-azidocelobiosa han sido sintetizados y evaluados como sustratos para las reacciones glicosintasa con el mutante E134S de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis y el mutante E197A de la celulasa de Humicola insolens, respectivamente. Se han sintetizado 6-azido y 6-amino-6-deoxicelulosas artificiales con una secuencia de funcionalización alternada. De forma opuesta a la modificación química de celulosas donde la secuencia de sustitución es intrínsicamente aleatoria, la polimerización catalizada por glicosintasas de dadores glicosídicos modificados apropiadamente, permite acceder a nuevas celulosas funcionalizadas con secuencias de sustitución definidas y regulares.


The glycosynthase technology has become a powerful enzymatic tool for the synthesis of oligosaccharides, polysaccharides and glycoconjugates. Glycosynthases are mutated glycosidases devoid of hydrolase activity but able to efficiently catalyze the formation of glycosidic bonds in high yields when using an activated glycosyl donor. In addition, the activated donor and its transglycosylation product, can both act as acceptors leading to the autocondensation of the donor or to the elongation of the transglycosylation product leading to polysaccharides. The present work aims to synthesize novel artificial functionalized polysaccharides with defined structures by the use of the glycosynthase technology. On the one hand, an increase in the molecular weight of the polysaccharides is attempted by the use of a carbohydrate binding module (CBM). This module might improve the solubility of the new polymers that are synthesized during the polymerization reaction. The effect on the polymerization degree has been studied for both the glycosynthase mutant in the presence of CBM and for the fusion protein glycosynthase-CBM. On the other hand, functionalized artificial polysaccharides have been synthesized from activated disaccharidyl donors where the desired functionalization has been introduced at position C-6’. These functionalized donors act as a substrate for the glycosynthase mutant that will catalyze the autocondensation reaction. The azido group was chosen as a suitable functional group given its versatility and its size, small enough to be accepted by the enzyme. Donors 6-azidolaminaribiosyl fluoride and 6-azidocellobiosyl fluoride have been synthesized and evaluated as substrates for the glycosynthase reactions by the E134S 1,3-1,4-β-glucanase from Bacillus licheniformis mutant and the E197A cellulase mutant from Humicola insolens, respectively. Artificial 6-azido- and 6-amino-6-deoxicelluloses with an alternating functionalization pattern have been produced. As opposed to chemically modified celluloses where the substitution pattern is intrinsically random, the glycosynthase-catalyzed polymerization of properly modified glycosyl donors gives access to novel functionalized celluloses with defined and regular substitution patterns.

Keywords

Polysaccharides; Glycosynthases; Enzymes; Functionalizations; Synthesis; Carbohydrates; 1,3-1,4-b-glucans; Cellulose; CBM; Regular pattern

Subjects

547 - Organic chemistry; 577 - Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics

Knowledge Area

Ciències

Documents

Final thesis Victoria Codera.pdf

9.414Mb

 

Rights

ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.

This item appears in the following Collection(s)