Anticancer Effect and Molecular Target Identification of Novel Anionophores in Lung Cancer

Abstract

Oral and lung cancer are included in the most prevalent respiratory diseases, being the latter one of the main causes of mortality worldwide. Despite new advances in diagnosis and clinical care, success of conventional treatments is still limited since patients end up developing resistances and presenting recurrences. Due to the therapeutic limitations to address these pathologies, it is necessary to identify new compounds, with different mechanisms of action and greater efficiency to overcome these neoplasms. Cancer cells acquire a series of characteristics during carcinogenesis, as a reversed pH gradient compared to normal cells, which favors cancer progression promoting proliferation and evasion of apoptosis. Recently, a new therapeutic strategy against cancer, which involves the modulation of intracellular pH has been proposed. Accordingly, our research group is focused on analyzing the potential of anion transporter compounds as new chemotherapeutic agents, since they possess the ability to selectively lower the intracellular pH. In particular, this doctoral thesis is focused on the anticancer effect characterization, at the cellular and molecular level, of novel anionophores, derived from natural compounds known as tambjamines. Firstly, the effect of the synthetic analogues on cell viability in oral and pulmonary cancer cell lines, as well as in cancer stem cells derived from patients’ tumors, has been determined, proving to be potent cytotoxic agents. Likewise, the implication of ion homeostasis disruption driven by these compounds has been studied at the cellular level. In this regard, it has been characterized how the compounds induce lysosomal alkalization and cause a massive vacuolization in the cytoplasm, which is consistent with mitochondrial swelling. These two phenomena led to the loss of function of both organelles. At the same time, the mechanisms of action linked to the osmotic imbalance caused by the compounds have been studied in detail. On one hand, it has been observed how these anionophores increase the activity of proteins related to cellular stress response, and how the apoptotic pathway is triggered, although this is not directly responsible for the death of the entire cell population. Likewise, an accumulation of autophagosomes, has been detected after treatment with these compounds, which might be related to the blockade of autophagy, consequence of the lysosomal failure after treatment with these compounds. Moreover, it has also been observed how the cells treated with these anionophores lose the integrity of the plasma membrane, indicating that the cytotoxic process culminates in necrosis in the vast majority of the cell population. Besides this, in this doctoral thesis, AKT protein has been identified as a potential molecular target of one of our compounds, using in silico docking experiments. In turn, it has been corroborated by surface plasmon resonance that the binding affinity between the selected tambjamine analogue and AKT is high, in the micromolar range. Likewise, a decrease in protein activity and in the total amount of AKT protein has been detected after treatment. Furthermore, the main signaling pathways involved in the cytotoxic process have been elucidated studying the modifications of miRNA expression patterns after the treatment with tambjamine, being the most affected PI3K / AKT, apoptosis and autophagy. Finally, to complete the preclinical studies, the toxicity and efficacy of these compounds in murine models of lung cancer have been evaluated in in vivo preliminary studies, showing a potent antitumor capacity in both ectopic and orthotopic models. Overall, these synthetic analogues of tambjamine may be considered a good tool to induce death in cancer cells through a new therapeutic strategy that modifies the intracellular pH and these compounds may become a good therapeutic option for apoptosis-resistant tumors.

El cáncer de cavidad oral y de pulmón se engloban dentro de las enfermedades de vías respiratorias más comunes, siendo este último una de las principales causas de mortalidad en el mundo. A pesar de los nuevos avances en el diagnóstico y la atención clínica, el éxito de los tratamientos convencionales es todavía limitado, ya que los pacientes acaban desarrollando resistencias y presentando recidivas. Debido a las limitaciones terapéuticas para abordar estas patologías, es necesario identificar nuevos compuestos con diferentes mecanismos de acción y mayor eficacia para combatir este tipo de neoplasias. Las células cancerosas adquieren una serie de características durante la carcinogénesis, como un gradiente de pH invertido en comparación con las células normales, lo cual favorece la progresión del cáncer mediante el aumento de la proliferación y la evasión de la apoptosis. Recientemente se ha propuesto una nueva estrategia terapéutica contra el cáncer la cual implica la modulación del pH intracelular. Es por esto que nuestro grupo de investigación estudia el potencial de compuestos transportadores de aniones como nuevos agentes quimioterapéuticos, ya que poseen la capacidad de disminuir el pH intracelular selectivamente. En concreto, este trabajo de tesis se ha centrado en caracterizar el efecto anticanceroso de anionóforos, compuestos transportadores de aniones, derivados de moléculas naturales llamadas tambjaminas, tanto a nivel celular como molecular. En primer lugar, se ha determinado el efecto de los análogos sintéticos de tambjamina sobre la viabilidad celular en líneas de cáncer oral y pulmonar, así como en células madre cancerosas derivadas de tumores de pacientes, demostrando ser potentes agentes citotóxicos. A su vez, se ha estudiado qué implicación tiene la pérdida de la homeostasis iónica impulsada por estos compuestos a nivel celular. En este sentido, se ha caracterizado cómo los compuestos inducen la alcalinización de los lisosomas, y provocan una vacuolización masiva en el citoplasma que se corresponde con el hinchamiento de la mitocondrias. Estos dos fenómenos conllevan la pérdida de función de ambos orgánulos. Al mismo tiempo, se han estudiado en detalle los mecanismos de acción ligados al desequilibrio osmótico provocado por los compuestos. Por una parte, se ha observado cómo estos anionóforos estimulan un aumento en la actividad de proteínas relacionadas con respuesta a estrés celular, y cómo provocan la activación de la vía apoptótica, sin que ésta sea la responsable directa de la muerte de toda la población celular. Conjuntamente, se ha detectado una acumulación de autofagosomas, relacionado con el bloqueo de la autofagia, consecuencia del fallo lisosomal tras el tratamiento con estos compuestos. A su vez, se ha podido observar cómo las células tratadas con estos anionóforos pierden la integridad de la membrana plasmática, indicando que el proceso citotóxico culmina en necrosis en una gran mayoría de la población celular. Por otro lado, en esta tesis doctoral, mediante experimentos computacionales in silico, se ha identificado la proteína AKT como una posible diana molecular de uno de nuestros compuestos. A su vez, se ha corroborado por espectroscopia mediante resonancia de plasmones superficiales, que la afinidad de unión entre el análogo de tambjamina y AKT es elevada, situada en un rango micromolar. Asimismo, se ha detectado una disminución tanto de la fosforilación, como de la proteína total AKT tras el tratamiento con tambjamina. Igualmente, gracias al estudio de la modificación de los patrones de expresión de miRNA tras el tratamiento con el compuesto, se han dilucidado las principales rutas de señalización involucradas en el proceso citotóxico, siendo las más afectadas PI3K/AKT, apoptosis y autofagia. Por último, para completar los estudios preclínicos, se ha evaluado la toxicidad y eficacia de estos compuestos in vivo en modelos murinos de cáncer de pulmón en estudios preliminares, mostrando una potente capacidad antitumoral tanto en el modelo ectópico como ortotópico. Por todo esto, los análogos sintéticos de tambjamina pueden ser considerados una buena herramienta para inducir muerte en células cancerosas mediante una nueva estrategia terapéutica que modifica el pH intracelular y podrían llegar a ser buenos fármacos para abordar el tratamiento de tumores resistentes a la apoptosis.