Control of redox homeostasis : environmental and genetic regulation of oxidative protein damage in Schizosaccharomyces pombe

Abstract

Oxidation of specific cysteines in proteins by hydrogen peroxide (H2O2) is a cellular mechanism that triggers signalling pathways, such as the antioxidant responses in microbial systems. However, H2O2 can be transformed to the more reactive radical hydroxyl OH▪ species, through the Fenton reaction, the main causative of protein carbonylations. These modifications can not be repaired, and constitute classical marks of oxidative damage. Along this thesis we were interested in studying and understand the consequences of reactive oxygen species (ROS) reactivity on proteins. Thus, we developed protocols for studying cysteine oxidations at the proteome level, upon treatment with H2O2 or in strains devoid of antioxidant systems, to characterize the more sensitive to oxidation and therefore the more prone to participate in redox events. We tried protocols for the identification of protein carbonyls, however we were unsuccessful due to the complexity of these type of modifications. Also, we studied the role of protein quality control pathways in the clearance of carbonylated proteins (protein aggregation results toxic for cells). Finally, we identified and characterized the main H2O2 scavengers in S. pombe and the identified the free methionine as a primary barrier in the defence against H2O2 stress.

La oxidación específica de cisteinas in proteinas por peróxido de hidrógeno (H2O2) es un mecanismo de activación de rutas de señalización. Sin embargo, el H2O2 puede también convertirse en radical hidroxilo (OH▪). Ésta es una especie reactiva de oxígeno (ERO) más reactiva que el H2O2, que da lugar a la formación de grupos carbonilo en proteinas. Los grupos carbonilo no pueden ser reparados y constituyen marcas de daño oxidativo. En esta tesis hemos estudiado las consecuencias de la reactividad de las ERO en proteínas. Así, hemos desarrollado protocolos para estudiar oxidaciones de cisteínas, tras tratamiento con H2O2 o en cepas manipuladas genéticamente, a nivel proteómico, caracterizando aquellas más reactivas, y por lo tanto más adecuadas para participar en señalización redox. Intentamos protocolos para identificar proteinas carboniladas, aunque sin éxito debido a la complejidad de este tipo de modificaciones. También hemos estudiado el papel de componentes que actuan en el control de calidad de proteinas en la degradación de proteinas carboniladas (la agregación y acumulación de proteinas es tóxica para la célula). Finalmente, hemos caracterizado los principales detoxificadores de H2O2 en S. pombe y hemos identificado la metionina como una barrera primera en la defensa contra el estrés por H2O2.