Mecanismos neuroprotectores de la eritropoyetina (NeuroEPO) en enfermedades neurodegenerativas

Abstract

La eritropoyetina (EPO) es una glucoproteína inicialmente identificada como una hormona sintetizada y secretada por el riñón que regula la eritropoyesis. Muchos estudios experimentales muestran que la EPO tiene una acción neuroprotectora en el cerebro. En trastornos neurológicos agudos y crónicos, particularmente en apoplejía, lesión cerebral traumática, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica y en accidente cerebro vascular, tiene efectos neuroprotectores. El objetivo de este estudio, utilizando un modelo in vitro, fue determinar cómo NeuroEPO, una variante de EPO con un bajo contenido de ácido siálico, protege a las neuronas de la acción excitotóxica del glutamato. Se utilizó cultivos neuronales primarios que se obtuvieron de la corteza cerebral de embriones de rata Wistar después de 17 días de gestación. La excitotoxicidad se indujo después de nueve días de cultivo in vitro mediante tratamiento con un medio que contenía glutamato 100 μM durante 15 minutos, para luego ser tratado con 100 ng / ml de NeuroEPO. Después de 24 h, el tratamiento mostró una disminución significativa (p <0,01) en la mortalidad, en comparación con las células tratadas con glutamato solo. El tratamiento NeuroEPO disminuyó la mortalidad y las células tendieron a reproducir las características morfológicas del control. Las imágenes obtenidas mediante microscopía de contraste de fases muestran que las neuronas tratadas con glutamato muestran una contracción corporal, pérdida de dendritas que no hacen contacto con las células vecinas y que NeuroEPO es capaz de preservar las características morfológicas del control. El estrés oxidativo inducido por el glutamato se reduce después del tratamiento con NeuroEPO. Las pruebas por inmunocitoquímica muestran que el cultivo es esencialmente puro en las neuronas, que el glutamato causa mortalidad celular, y que esto se evita parcialmente cuando en el medio de cultivo se añade NeuroEPO. Se analizó también la activación de las vías apoptóticas intrínsecas. La disminución en la relación Bcl-2 / Bax, fue determinante en la liberación de citocromo c desde la mitocondria hacia el citosol y en la expresión y la actividad de caspasa-3 observada en las células tratadas solo con glutamato. Estas alteraciones fueron evitadas en las células bajo tratamiento con NeuroEPO posterior al glutamato. Estos resultados permiten aseverar que NeuroEPO ejerce su función neuroprotectora actuando directamente sobre las neuronas una vez que se ha inducido la excitotoxicidad del glutamato, puede atenuar sustancialmente los cambios morfológicos causados por la excitotoxicidad inducida por glutamato en las neuronas, reduciendo el efecto neurotóxico que éste ejerce sobre la viabilidad neuronal, protege a las neuronas del estrés oxidativo y de la apoptosis inducidos por el glutamato mediante el manteniendo el equilibrio entre proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2) y pro-apoptóticas (Bax), evitando la liberación al citosol del citocromo c y reduciendo la actividad de la caspasa-3. Los bajos niveles de ácido siálico de la NeuroEPO comparados con la rhEPO al parecer no afectan a la actividad neuroprotectora de la NeuroEPO.

Erythropoietin (EPO) is a glycoprotein initially identified as a hormone synthesized and secreted by the kidney that regulates erythropoiesis. Many experimental studies show that EPO has a neuroprotective action in the brain. In acute and chronic neurological disorders, particularly in stroke, traumatic brain injury, Alzheimer's disease, Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis, it has neuroprotective effects. The objective of this study, using an in vitro model, was to determine how NeuroEPO, a variant of EPO with a low content of sialic acid, protects neurons from the toxic action of glutamate. Primary neuronal cultures that were obtained from the cerebral cortex of Wistar rat embryos after 17 days of gestation were used. The excitotoxicity was induced after nine days of in vitro culture by treatment with a medium containing 100 μM glutamate for 15 minutes. After 24 h, treatment with 100 ng of NeuroEPO / ml showed a significant decrease (p <0.01) in mortality, compared to cells treated with glutamate alone. The NeuroEPO treatment decreased mortality and tended to reproduce the morphological characteristics of the control. The oxidative stress induced by glutamate is reduced after treatment with NeuroEPO. The images obtained by phase contrast microscopy show that neurons treated with glutamate show a body contraction, loss of dendrites that do not make contact with neighboring cells, and NeuroEPO is capable of preserving the morphological characteristics of the control. Immunocytochemistry tests show that the culture is essentially pure in neurons, that glutamate causes cell mortality, and that this is partially avoided when NeuroEPO is added to the culture medium. The activation of the intrinsic apoptotic pathways was also analyzed. The decrease in the Bcl-2 / Bax ratio was decisive in the release of cytochrome from the mitochondria to the cytosol and in the expression and activity of caspase-3 observed in the cells treated with glutamate. These alterations were avoided in the cells under treatment with NeuroEPO. These results confirm that NeuroEPO has a protective effect against the neuronal damage induced by excitotoxicity, improving the antioxidant activity in the neuron and protecting it from oxidative stress; In addition, they show that NeuroEPO protects cortical neurons from glutamate-induced apoptosis by up-regulating Bcl-2 and inhibits the activation of caspase-3 induced by excitotoxicity due to glutamate.