Molecular and cellular mechanisms of fertilization failure after ICSI

Abstract

La ICSI és una tècnica de reproducció assistida molt eficient, però la fallada de fecundació (FF) pot ocórrer en un 1-3% dels cicles. La FF té un elevat impacte en els pacients i és molt difícil de predir, diagnosticar i gestionar a nivell clínic. L'objectiu d'aquesta tesi és caracteritzar i identificar els mecanismes espermàtics responsables de la FF en ICSI. S'han estudiat les principals proteïnes de l’espermatozoide implicades en l'activació de l’oòcit: PAWP i PLCZ1. Els nivells de PAWP, la seva ubicació subcel·lular i la seqüència gènica no van mostrar alteracions en pacients amb FF. D'altra banda, vam identificar mutacions en PLCZ1 en un alt percentatge de pacients amb fallada d'activació de l’oòcit (12/22, 55%), l’efecte deleteri de les quals va ser determinat per anàlisi funcional (injectant cRNA de PLCZ1 en oòcits humans madurats in vitro). La longitud telomèrica en espermatozoides (STL) es va determinar en 60 mostres de donant de semen utilitzats en 676 cicles d'ICSI, permetent-nos d'aïllar estadísticament la STL del factor femení. Tot i així, no es va trobar cap efecte significatiu de la STL en les taxes de fertilitat i embaràs. A més, per primera vegada, es va dur a terme un estudi de proteòmica comparant mostres de semen amb una bona fecundació (n-8) i mostres amb FF repetitiva post-ICSI (n-4). Aquesta anàlisi va identificar 11 proteïnes diferencialment expressades entre pacients amb FF i controls, algunes d'elles validades per Western blot, com DLAT i PSMA1. Mitjançant anàlisis funcionals addicionals es va observar que les mostres espermàtiques de pacients amb FF tenen menor activitat mitocondrial i menys activitat proteasomal que els controls. Finalment, mitjançant l'anàlisi de fins a 125 cicles de ICSI amb FF, vam poder observar que una sola evidència prèvia de FF no és una justificació suficient per recomanar l'activació assistida de l’oòcit (AOA). En resum, aquesta tesi inclou una àmplia caracterització molecular de mostres de pacients amb FF, i proporciona una llista de marcadors i eines amb potencial ús a nivell clínic.

ICSI is a very efficient assisted reproduction technique, but fertilization failure (FF) occurs in 1-3% of cycles. FF has a high impact on patients and is very difficult to predict, diagnose and manage in the clinic. The aim of this thesis is to characterize and identify the sperm alterations explaining FF after ICSI. The main sperm proteins involved in oocyte activation have been studied: PAWP and PLCZ1. PAWP levels, its subcellular location and its gene sequence did not show alterations in patients with FF. On the other hand, we identified presence of mutations in PLCZ1 gene in a high percentage of patients with oocyte activation failure (12/22, 55%). The deleterious effect of these mutations was confirmed by functional analysis (injecting PLCZ1 cRNA into in vitro-ripened human oocytes). Moreover, sperm telomere length (STL) was determined in samples from 60 sperm donors used in 676 ICSI cycles, allowing us to statistically isolate the female factor from STL. However, we did not find any significant effect of STL on fertilization and pregnancy rates. In addition, for the first time, semen samples with good fertilization rate (n = 8) and samples with repetitive FF post-ICSI (n = 4) were compared by high-throughput proteomics. This analysis identified 11 proteins differentiated expressed between patients with FF and controls, some of them validated by Western Blot (such as DLAT and PSMA1). Functional analysis demonstrated that sperm samples from patients with FF presented lower mitochondrial activity and less proteasomal activity than the controls. Finally, by the analysis of up to 125 ICSI cycles with FF, we observed that a single previous evidence of FF is not an enough justification to recommend assisted oocyte activation (AOA). In summary, this thesis includes a comprehensive molecular characterization of sperm-dependent fertilization failure after ICSI, and provides a list of biomarkers and tools with potential use at the clinical level.