Exploration of Extracellular Vesicles as a Novel Approach for Antigen Discovery and Vaccine Development against Plasmodium vivax Malaria

Abstract

Plasmodium vivax is the most geographically widespread human malaria parasite. Research on this parasite needs to be expanded in order to develop adequate tools for its control such as a highly effective vaccine. One particular feature of P. vivax is its preference to invade immature red blood cells, also known as reticulocytes. Interestingly, ultrastructural studies performed on reticulocytes enabled the discovery of exosomes, extracellular vesicles (EVs) of endocytic origin. These vesicles were initially seen as a selective cargo-disposal pathway, but later works showed the involvement of exosomes, and other extracellular vesicles, in a variety of biological processes. Importantly, exosomes derived from reticulocytes infected with P. yoelii, a murine reticulocyte-prone parasite that resembles P. vivax, contained parasite proteins. When used in CpG-adjuvanted immunizations, exosomes were able to elicit long-lasting protective responses. This thesis hypothesizes that exosomes derived from P. vivax-infected reticulocytes contain parasite antigens and stimulate immune responses. We evaluated the potential of circulating extracellular vesicles from P. vivax infections as a source of antigens and as activators of T-cell responses, and explored human reticulocyte-derived exosomes as a vaccine platform against P. vivax malaria. We isolated EVs from plasma of P. vivax-infected patients and determined their protein composition by mass spectrometry-based proteomics in order to unveil their potential use in antigen discovery. We found parasite proteins associated to these vesicles that could serve as antigens. Indeed, two of the identified vivax proteins present promising cytotoxic T-cell epitopes as evidenced by in silico analysis. Moreover, we detected HLA class I molecules and observed an altered protein cargo in vesicles from vivax patients compared to healthy donors, thus suggesting that circulating EVs might affect the course of P. vivax infection. Next, we evaluated the in vitro interaction of these vesicles with leukocyte populations from the human spleen, given the importance of this organ in the induction of adaptative immune responses. Remarkably, we observed a significant interaction of monocytes, B-cells and T-cells with vesicles from patients compared to healthy individuals. We studied the capacity of these vesicles to activate T-cells, and preliminary results indicate that circulating vesicles from infections might stimulate CD8+ T-cell responses. Recent studies highlighted the role of cytotoxic CD8+ T-cell responses against P. vivax blood-stage parasites. In parallel, we studied the proteomic composition of exosomes derived from human reticulocytes and analyzed their ability to interact with antigen-presenting cells. We identified over 300 proteins in these vesicles, including HLA class I molecules, and found that these exosomes could be taken up by antigen-presenting cells, thus suggesting their contribution to the presentation of antigens. Collectively, our results indicate that EVs from vivax infections can be used in antigen discovery and might contribute to cell-mediated immune responses that could be critical for vivax control. In particular, reticulocyte-derived exosomes represent a potential vaccine platform to be furtherly explored. We believe this work has provided novel insights for vaccine development against P. vivax malaria.

Plasmodium vivax es el parásito que causa malaria humana más extendido geográficamente. Se ha de ampliar la investigación sobre este parásito para desarrollar herramientas adecuadas para su control, entre ellas, una vacuna altamente efectiva. Una característica particular de P. vivax es su preferencia por invadir glóbulos rojos inmaduros, también conocidos como reticulocitos. Curiosamente, estudios ultraestructurales realizados en reticulocitos permitieron el descubrimiento de exosomas, vesículas extracelulares (VEs) de origen endocítico. Los exosomas y otras vesículas extracelulares, fueron vistos inicialmente como una vía selectiva de eliminación de proteínas obsoletas, pero en la actualidad, se sabe que participan en una gran variedad de procesos biológicos. Los exosomas derivados de reticulocitos infectados con P. yoelii, un parásito propenso a invadir reticulocitos murinos que se asemeja a P. vivax, contienen proteínas parasitarias. Cuando estos exosomas se usan en inmunizaciones con adyuvante de CpG son capaces de provocar respuestas protectoras duraderas. Esta tesis plantea la hipótesis de que los exosomas derivados de reticulocitos infectados con P. vivax contienen antígenos del parásito y pueden estimular respuestas inmunes. Evaluamos el potencial de las VEs circulantes en infecciones de P. vivax como fuente de antígenos y como activadoras de respuestas de células T. Además, exploramos los exosomas derivados de reticulocitos humanos como una plataforma de vacunación contra la malaria vivax. Aislamos VEs del plasma de pacientes infectados con P. vivax y determinamos su composición proteica mediante proteómica basada en espectrometría de masas para investigar su potencial uso en el descubrimiento de antígenos. Encontramos proteínas del parásito asociadas a estas vesículas, las cuales podrían actuar como antígenos. De hecho, el análisis in silico de dos de estas proteínas reveló prometedores epítopos citotóxicos de células T. Además, detectamos moléculas HLA clase I y observamos un alterado contenido de proteínas en las vesículas de pacientes con vivax en comparación con donantes sanos, lo que sugiere que los VEs circulantes podrían afectar el curso de la infección por P. vivax. A continuación, evaluamos la interacción in vitro de estas vesículas con poblaciones leucocitarias del bazo humano, dada la importancia de este órgano en la inducción de respuestas inmunes adaptativas. Observamos una interacción significativamente elevada de monocitos, células B y células T con vesículas de pacientes en comparación con VEs de individuos sanos. Estudiamos la capacidad de estas vesículas para activar las células T, y los resultados preliminares indican que las vesículas circulantes de infecciones de vivax podrían estimular las respuestas de las células T CD8+. Recientes estudios han destacado el posible papel de las respuestas citotóxicas de las células T contra los parásitos de la etapa sanguínea de P. vivax. Paralelamente, analizamos la composición proteómica de los exosomas derivados de reticulocitos humanos y determinamos su capacidad para interactuar con células presentadoras de antígenos. Identificamos más de 300 proteínas en estas vesículas, incluidas las moléculas HLA de clase I, y descubrimos que estos exosomas podían ser internalizados por células presentadoras de antígenos, lo que sugiere su contribución a la presentación antigénica. En conjunto, nuestros resultados indican que las VEs de las infecciones por vivax pueden usarse en el descubrimiento de antígenos y pueden contribuir a respuestas inmunes mediadas por células que podrían ser críticas para el control de vivax. En particular, los exosomas derivados de reticulocitos representan una potencial plataforma de vacuna. Creemos que este trabajo ha proporcionado nuevas ideas para el desarrollo de vacunas contra la malaria por P. vivax.