Evaluation of biotoxins in marine ecosystems by new analytical and biological strategies

Abstract

In this thesis is presented the development of different analytical methodologies for the analysis of marine biotoxins in seawater. The objectives were the development of the methods and the application to study the biotoxins in marine environments as well as to use it as early warning tools able to detect the presence of the biotoxins at low concentrations previous to an algal bloom development. The analytical development has been carried out evaluating the precision, accuracy, selectivity and sensibility of the methods. Due to the diverse physic-chemical properties between the different groups of toxins, three different methodologies have been created. First step of the methods consisted in a sample pre-treatment to eliminate the possible interferences in the sample that could difficult the instrumental analysis. For this reason, the biotoxins were extracted from seawater and concentrated to achieve better sensibility. Then, the seawater was filtered and the particulate and filtrate portions were separated, treated and analysed separately. The extraction of the biotoxins form the particulate was carried out with methanol and assisted with ultrasounds. For the filtrate portion solid phase extraction was employed at different conditions conditioned by the different groups of biotoxins. The analysis of the extracts was performed by high performance liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry through the ionization by electrospray. The chromatographic separation was carried out by hydrophilic interaction and reversed phase modes. The acquisition mode for the mass spectrometry was the combination of full scan at high resolution with tandem mass. After being validated, the three methodologies were applied to study the occurrence of the different biotoxins in the Mediterranean Sea. In the Catalan’s littoral, okadaic acid was found in concentrations ranging from 2 ng/L to 9.5 µg/L. Domoic acid was also present in the study of Ebro delta, reaching the highest concentration of 69.5 ng/L during summer. Also, the most hydrophilic marine toxins were studied in Mar Menor, Murcia, but any of the toxins was detected. Finally, one of the methods was used to validate an immunoassay capable to detect and quantify five pollutants in seawater, being one of them domoic acid.

La tesis doctoral presenta el desarrollo de diversas metodologías analíticas para el análisis de biotoxinas marinas en agua de mar. Las técnicas utilizadas son la cromatografía líquida de alta eficacia acoplada a la espectrometría de masas de alta resolución. El objetivo de estos métodos de análisis es su utilización en el estudio de las biotoxinas marinas en el medio marino, así como su aplicación para la temprana detección de estos compuestos cuando están a bajas concentraciones, con el fin de anticiparse a la posible formación de eventos de floraciones algares nocivas donde la concentración de las biotoxinas podría ser muy elevada y provocar impactos negativos en el ecosistema y en las actividades de maricultura. El desarrollo analítico se ha realizado evaluando la precisión, exactitud, selectividad y sensibilidad de los métodos. Dado que las propiedades físico-químicas de los diferentes grupos de biotoxinas son muy diversas, se han tenido de desarrollar tres metodologías diferentes. La primera etapa para todas consiste en un tratamiento de muestra ya que es esencial eliminar posibles interferencias en la muestra para su posterior análisis mediante las dichas técnicas instrumentales, por lo que las biotoxinas fueron extraídas del agua de mar y concentradas. Primeramente, se filtra el agua de mar y se separa la porción de materia en suspensión y la parte del filtrado para ser tratadas y analizadas por separado. La extracción de las biotoxinas de la porción de materia en suspensión se realiza con metanol y se asiste con ultrasonidos. La fracción del filtrado se somete a una extracción en fase sólida en diferentes condiciones dependiendo del grupo de toxinas. El análisis de los extractos, se realiza mediante cromatografía liquida de alta eficacia acoplada a espectrometría de masas de alta resolución mediante la ionización por electroespray. La separación de los compuestos más polares, se realizó mediante cromatografía líquida de interacción hidrofílica mientras que para los más apolares fue de tipo fase inversa. La adquisición utilizada en la espectrometría de masas fue mediante la combinación de un barrido completo en alta resolución y la fragmentación de los iones precursores, tipo tándem de masas, para cada una de las toxinas a resolución más baja. Una vez validadas, las tres metodologías se emplearon en el estudio de biotoxinas en el mar Mediterráneo, concretamente en el litoral catalán y murciano. Las biotoxinas más apolares se investigaron a lo largo de la costa catalana, mediante muestras recolectadas en playas públicas y puestos deportivos en diferentes localidades. El 88 % de esas muestras había una de las toxinas más frecuentemente hallada en el mar Mediterráneo, el ácido okadaico, el cual estaba en rangos de concentración de entre 2 ng/L y 9,5 µg/L. Por otro lado, el ácido domoico, se estudió en la zona de la desembocadura del rio Ebro, que consta de una zona de humedales y dos bahías donde se llevan a cabo actividades de maricultura. Su presencia destacó en las bahías especialmente en las muestras colectadas en verano, aunque la concentración más alta llegó a los 69,5 ng/L. Finalmente, las biotoxinas más polares se analizaron en aguas de la laguna salada del Mar Menor, en Murcia. Sin embargo, no se detectó la presencia de ninguna. Por otro lado, una de los métodos se utilizó para la validación de un inmunoensayo previamente desarrollado, capaz de detectar y cuantificar cinco grupos de contaminantes en agua de mar, siendo uno de ellos una biotoxina, el ácido domoico. Al immunoensayo se le añadió una etapa de tratamiento de muestra en que se pudieron concentrar los diferentes compuestos y conseguir así una detectabilidad a concentraciones muy bajas, del rango de los ng/L. Para concluir, se podría decir que los métodos desarrollados proporcionan mucha sensibilidad y selectividad en el análisis de biotoxinas marinas en agua de mar y que además, gracias a la alta resolución de las técnicas instrumentales, se podría estudiar la caracterización de compuestos nuevos.