Actividad de la proteina intrínsecamente desordenada p15(PAF) en el replisoma o cómo el desorden orquesta la replicación celular

Abstract

La abrazadera deslizante eucariota (PCNA), juega un papel esencial como componente del replisoma. PCNA, de forma toroidal, rodea el DNA y ata las polimerasas y otros factores a la plantilla genómica para una síntesis rápida y procesiva. PCNA puede deslizar bidireccionalmente a lo largo del dúplex de DNA rastreando su columna vertebral mediante un mecanismo de «rueda dentada» basado en interacciones polares efímeras que mantienen la orientación de la pinza invariante en relación con la doble hélice. La mutación de residuos en esta interfaz de interacción PCNA-DNA hace desfavorable el inicio de la síntesis de DNA por Pol δ, por lo tanto, es necesaria una pinza orientada correctamente en el DNA para el ensamblaje de una holoenzima pol δ-PCNA competente en replicación. La cara del interior del anillo de PCNA, además de ser crucial para la función de PCNA como factor de procesividad durante la replicación, está altamente regulada para controlar la resistencia al daño en el DNA. Se puede modular (i) a través de la acetilación de su lisina 20, lo que estimula la reparación por recombinación homóloga, o (ii) mediante la unión de p15PAF, lo que desactiva el baipás de lesión en el DNA. p15PAF es una proteína intrínsecamente desordenada que atraviesa el canal del anillo de PCNA, uniendo su dominio PIP-box al bolsillo hidrofóbico de la cara frontal de la pinza y estableciendo contactos también con la superficie deslizante de la abrazadera para asomar su cola N-terminal por la cara trasera. Cuando dos moléculas de p15PAF ocupan dos subunidades del homotrímero de PCNA, el DNA dentro del canal del anillo se une a la subunidad que queda desocupada y no desplaza a p15PAF de la pared del anillo interno de PCNA. Cuando p15PAF está unida a PCNA, se reduce la superficie deslizante disponible de la abrazadera, así que p15PAF puede estar funcionando como un cinturón que abrocha el DNA a PCNA durante la síntesis por la polimerasa replicativa Pol δ. Esta restricción de la superficie deslizante, sin embargo, necesita ser eliminada para un baipás eficaz de la lesión del DNA por parte de la polimerasa de síntesis translesión Pol η. PCNA es estable en forma de anillo cerrado y, por lo tanto, debe cargarse activamente en las uniones cebador/plantilla del DNA, colocándose exactamente en el lugar y posición correctas para una replicación procesiva. La apertura y carga de PCNA la lleva a cabo el cargador de la pinza RFC. Una vez en el DNA, PCNA se vuelve a sellar alrededor del DNA y entonces el cargador de la pinza es expulsado. Cuando PCNA ya no es necesaria anclada en el DNA, el complejo RFC es el encargado de retirarla abriéndola y soltándola fuera de la doble hebra. Pero la flexibilidad intrínseca de PCNA hace que tenga cierta predisposición a estar en estado abierto separando dos de sus subunidades a través de su interfaz. Esto, que favorece la apertura del anillo por parte de RFC para lograr el ensamblado alrededor del DNA, puede ser un problema para mantenerla cerrada en la unión cebador/plantilla. De hecho, la estabilidad de las interfaces entre subunidades de PCNA disminuye cuando se une al DNA después de ser cargada por RFC, y dicha estabilidad solo la ve recuperada cuando p15PAF se ancla por su dominio PIP-box a sus bolsillos hidrofóbicos, grapando así las subunidades de la pinza e impidiendo su salida prematura del complejo con el DNA. Además de estabilizar la forma cerrada del anillo de PCNA, cuando p15PAF está anclada a su cara frontal, impide que RFC se aproxime, se una a ella y la desenganche de la unión cebador/plantilla.

The eukaryotic sliding clamp (PCNA) is an essential replisome's component. PCNA, with a toroidal shape, surrounds DNA and binds polymerases and other factors to the genomic template for rapid and processive synthesis. PCNA can slide bi-directionally along the DNA duplex using a "cogwheel" mechanism based on ephemeral polar interactions that maintain the orientation of the clamp invariant relative to the double helix. However, mutations in the PCNA-DNA interaction interface render unfavourable the initiation of DNA synthesis by Pol δ. Therefore, a correctly oriented clamp on the DNA is necessary to assemble a competent pol δ-PCNA holoenzyme. Tight regulation of the inner face of PCNA, which is crucial for PCNA function as a processivity factor during replication, controls the DNA damage resistance. The inner PCNA ring face can be regulated (i) through acetylation of its lysine 20, which stimulates repair by homologous recombination, or (ii) by p15PAF binding, which deactivates the bypass of DNA damage. p15PAF is an intrinsically disordered protein that crosses the channel of the PCNA ring, attaching its PIP-box domain to the hydrophobic pocket on the front face of the clamp and establishing contacts with the sliding surface to show its N-terminal tail through the rear face. When two p15PAF molecules occupy two subunits of the PCNA homotrimer, the DNA within the ring channel binds to the unoccupied subunit and does not displace p15PAF from the inner ring wall of PCNA. When p15PAF is bound to PCNA, the available slip surface of the clamp is reduced, so p15PAF may be functioning as a belt that binds DNA to PCNA during synthesis by the replicative polymerase Pol δ. This sliding surface restriction, however, needs to be removed for efficient bypass of DNA damage by the translesion synthesis polymerase Pol η. PCNA is a stable closed ring and must be actively loaded onto the primer/template junctions of DNA, getting precisely in the right place and position for processive replication. RFC clamp loader opens and loads PCNA onto the DNA. Once in the DNA, PCNA reseals around the DNA and RFC is then ejected. When PCNA is no longer needed around the DNA, the RFC complex opens and unloads it. But the local flexibility of PCNA's subunits interfaces makes it have a certain predisposition to be in the open state. This local flexibility, which favours the RFC opening of the ring to achieve assembly around the DNA, can be a problem in keeping it closed at the primer/template junction. Furthermore, the stability of the interfaces between PCNA subunits decreases further when it binds to DNA. Interestingly, the PCNA homotrimer interfaces stability recovers when p15PAF is anchored by its PIP-box domain to PCNA's hydrophobic pockets, thus stapling the clamp subunits and preventing their premature exit from the complex with DNA. In addition, when p15PAF is anchored to PCNA front face, it prevents RFC from approaching, binding to, and unloading PCNA from the primer/template junction.