Cold plasma-treated hydrogels for multimodal cancer therapy

Abstract

(English) Cold atmospheric plasma (hereon just plasma) is a weakly ionized gas that gained attention as a cost-efficient and well-tolerated cancer treatment that selectively targets the altered redox metabolism of malignant cells. The short penetration depth of direct plasma treatment limits its clinical applications to surface targets. Plasma-treated hydrogels (PTHs) emerge as vehicles for local delivery of therapeutic plasma-derived reactive oxygen and nitrogen species (RONS) to internal targets. To prepare a PTH, an aqueous solution containing low concentrations of polymers is exposed to plasma to enrich it with RONS and is then crosslinked into the three-dimensional hydrogel network entrapping RONS inside. Once in contact with the target, RONS can diffuse from PTH and, above a cell-specific threshold, cause irreversible damage and death to cancer cells. Importantly, PTHs could broaden the clinical application of plasma not only by acting as RONS vehicles but also by being a versatile physicochemical platform that can incorporate different bioactive polymers or drugs for combined therapeutic effects, as explored for the first time in this Thesis. This Thesis proposes and follows an iterative workflow cycle for the development and characterization of PTHs. Here, alginate was chosen as a biopolymer for the preparation of PTHs, due to its biocompatibility, relevance, and versatility in biomedical research, as well as the ability to crosslink under mild conditions. In the first place, an optimized protocol for the preparation of alginate-based PTHs was identified, in order to ensure high retention of therapeutic RONS during the crosslinking process and obtain an injectable, shear-thinning formulation useful for minimally-invasive delivery and shape-adaptability of the PTH. Before this Thesis, biological characterization of PTHs was limited to cancer cytotoxicity reports. Here, the ability of a PTH to induce immunogenic cell death was demonstrated for the first time. As a result, PTH-treated osteosarcoma cells were increasingly phagocytized when co-cultured with immature dendritic cells derived from human monocytes isolated from healthy blood donors. Following the initial physicochemical and biological characterization, the feasibility and efficacy of incorporating a secondary therapeutic modality to the PTH were investigated. For this, a bioactive polymer or a chemotherapeutic drug was introduced into the alginate PTH formulation to achieve biological effects beyond or in synergy with plasma-derived RONS. Importantly, these effects were studied in a relevant model: an in ovo cancer model, where three-dimensional and vascularized tumors were grown on the membrane of a fertilized chicken egg (in ovo). This enabled the assessment of cancer cells in an environment more similar to a native, clinical one. In ovo tumor models emerge as cost- and time-effective models and can help replace, reduce, and refine in vivo experiments in preclinical research. In contrast to mono-therapy with PTH or drug alone, which showed no effect in ovo, a single administration of PTH-drug co-therapy could diminish osteosarcoma tumor weight and the expression of a protein linked to treatment resistance. Altogether, the work presented in this PhD Thesis helped characterize and establish PTHs within the plasma community as a novel modality that can broaden the clinical application of plasma. Furthermore, it provided a proof of concept that PTHs can be used as versatile dual platforms for multimodal cancer management.

(Català) El plasma fred a pressió atmosfèrica (en endavant, simplement plasma) és un gas feblement ionitzat que ha rebut atenció com a tractament econòmic contra el càncer que és ben tolerat, i és capaç d'actuar de manera selectiva sobre el metabolisme redox alterat de les cèl·lules malignes. La poca profunditat de penetració del plasma directe en els teixits, en limita les aplicacions clíniques a dianes superficials. Els hidrogels tractats amb plasma (PTHs, per les sigles en anglès) emergeixen com a vehicles per a l’administració local d’espècies reactives d’oxigen i nitrogen derivades del plasma (RONS, per les sigles en anglès) cap a teixits interns. Per preparar un PTH, una solució aquosa amb concentracions baixes de polímers s’exposa al plasma per enriquir-la amb RONS i posteriorment es reticula en una xarxa tridimensional formant un hidrogel que atrapa aquestes espècies en el seu interior. Un cop en contacte amb la diana, els RONS es poden difondre des del PTH i, superant un llindar específic per a cada tipus de cèl·lula, poden causar dany irreversible i mort de les cèl·lules canceroses. Els PTHs podrien ampliar les aplicacions clíniques del plasma no només com a vehicles de RONS, sinó també com a plataformes fisicoquímiques versàtils, capaces d’incorporar diferents polímers bioactius o fàrmacs per aconseguir efectes terapèutics combinats, tal com s’explora per primera vegada en aquesta Tesi. Aquesta Tesi proposa i segueix un cicle iteratiu de treball per al desenvolupament i caracterització dels PTHs. Es va seleccionar alginat com a biopolímer per a la preparació dels PTHs, degut a la seva biocompatibilitat, rellevància i versatilitat en investigació biomèdica, així com a la seva capacitat de reticulació en condicions suaus. En primer lloc, es va identificar un protocol optimitzat per preparar PTH d’alginat, assegurant una alta retenció de RONS terapèutics durant la reticulació i obtenint una formulació injectable, amb comportament pseudoplàstic, útil per a una administració mínimament invasiva i adaptable en forma. Abans d’aquesta Tesi, la caracterització biològica dels PTHs es limitava a l’avaluació de citotoxicitat en càncer. Aquí, per primera vegada, es va observar la capacitat d’un PTH per induir mort cel·lular immunogènica. Les cèl·lules d’osteosarcoma tractades amb PTH van ser fagocitades amb més freqüència quan es van co-cultivar amb cèl·lules dendrítiques immadures derivades de monòcits humans obtinguts de donants sans. Després de la caracterització fisicoquímica i biològica inicial, es va investigar la viabilitat i l'eficàcia d'incorporar una modalitat terapèutica secundària a PTH. Per això, es va introducir un polímer bioactiu o un agent de quimioteràpia en la formulació d’alginat per avaluar la possibilitat d’aconseguir efectes biològics superiors als proporcionats pels RONS o en sinergia amb ells. Aquests efectes es van observar en un model tumoral in ovo, on tumors tridimensionals vascularitzats es van cultivar sobre la membrana d’un ou de gallina fertilitzat (in ovo). Això va permetre avaluar les cèl·lules en un entorn més similar al natiu i de rellevància clínica. Els models tumorals in ovo emergeixen com a models rendibles i eficaços i poden ajudar a reemplaçar, reduir i refinar els experiments in vivo en la investigació preclínica. A diferència de les monoteràpies amb PTH o fàrmac, que no van mostrar efecte in ovo, després d'una sola administració de la PTH-fàrmac co-teràpia, es podria disminuir el pes del tumor d'osteosarcoma i l'expressió d'una proteïna relacionada amb la resistència al tractament. En conjunt, aquesta Tesi Doctoral ha establert els PTHs com una modalitat de tractament innovadora dins la comunitat del plasma, ampliant-ne les aplicacions clíniques. A més, ha demostrat que els PTH podrien actuar com a plataformes duals versàtils per al tractament multimodal del càncer.

(Español) El plasma frío a presión atmosférica (en adelante simplemente plasma) es un gas débilmente ionizado que ha ganado atención como un tratamiento económico contra el cáncer, bien tolerado y que se dirige selectivamente al metabolismo redox alterado de las células malignas. La escasa profundidad de penetración del plasma directo en los tejidos, limita sus aplicaciones clínicas a dianas superficiales. Los hidrogeles tratados con plasma (PTHs) emergen como vehículos para la administración local de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno derivadas del plasma (RONS) hacia tejidos internos. Para preparar un PTH, una solución acuosa que contiene concentraciones bajas de polímeros se expone al plasma para enriquecerla con RONS y luego se reticula en una red tridimensional formando un hidrogel que atrapa los RONS en su interior. Una vez en contacto con la diana, los RONS pueden difundirse desde el PTH y, por encima de un umbral, causar daño irreversible y muerte de las células cancerosas. Los PTHs podrían ampliar la aplicación clínica del plasma no solo actuando como vehículos de RONS, sino también como una plataforma físico-química versátil que puede incorporar diferentes polímeros bioactivos o medicamentos para efectos terapéuticos combinados, como se explora por primera vez en esta Tesis. Esta Tesis propone y sigue un ciclo iterativo de trabajo para el desarrollo y caracterización de los PTHs. Aquí, se eligió alginato como biopolímero para la preparación de PTHs, debido a su biocompatibilidad, relevancia y versatilidad en la investigación biomédica, así como a su capacidad para reticular bajo condiciones suaves. En primer lugar, se identificó un protocolo optimizado para la preparación de PTH a base de alginato, con el fin de asegurar una alta retención de RONS terapéuticos durante el proceso de reticulación y obtener una formulación inyectable con comportamiento pseudoplástico para una administración mínimamente invasiva y adaptable en forma. Antes de esta Tesis, la caracterización biológica de los PTHs estaba limitada a la evaluación de su de citotoxicidad en cáncer. Aquí, por primera vez, se observó la capacidad de un PTH para inducir muerte celular inmunogénica. Se observó que las células de osteosarcoma tratadas con PTH son fagocitadas con mayor frecuencia cuando se co-cultivan con células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos humanos aislados de donantes de sangre sanos. Tras la caracterización fisicoquímica y biológica inicial, se investigó la viabilidad y eficacia de incorporar una modalidad terapéutica secundaria a PTH. Para ello, se introdujo un polímero bioactivo o un agente de quimioterapia en la formulación de PTH de alginato para obtener efectos biológicos superiores a los proporcionados por los RONS derivados del plasma o en sinergia con ellos. Estos efectos se observaron en un modelo relevante de cáncer, donde tumores tridimensionales y vascularizados se cultivaron en la membrana de un huevo de gallina fertilizado (in ovo), permitiendo estudiar las células cancerosas en un entorno tumoral más similar a uno nativo con mayor relevancia clínica. Los modelos tumorales in ovo emergen como modelos rentables y eficaces y pueden ayudar a reemplazar, reducir y refinar los experimentos in vivo en la investigación preclínica. En contraste con las monoterapias (PTH o fármaco), que no mostraron efecto in ovo, tras una sola administración de la PTH-fármaco co-terapia, se podría disminuir el peso del tumor de osteosarcoma y la expresión de una proteína relacionada con la resistencia al tratamiento. En conjunto, el trabajo presentado en esta Tesis Doctoral ha contribuido a establecer los PTH dentro de la comunidad del plasma como una modalidad de tratamiento novedosa que podría ampliar las aplicaciones clínicas del plasma. Además, ha proporcionado una prueba de concepto de que los PTHs podrían utilizarse como plataformas duales versátiles para el manejo multimodal del cáncer.