Exploring the potential of EVs as biological mRNA delivery systems

Abstract

Les vesícules extracel·lulars (VEs) són cada cop més reconegudes pel seu potencial com a sistemes naturals de lliurament de fàrmacs o gens en aplicacions terapèutiques. No obstant, els avenços en la seva manipulació, aïllament i caracterització no han evolucionat en paral·lel amb aquest interès. La manca de protocols estandarditzats per a l’aïllament i caracterització de les VEs afecta tant a la qualitat com la producció de VEs, comprometen la fiabilitat experimental. A més, la recerca sobre condicions òptimes d'emmagatzematge és limitada, la qual cosa és essencial per mantenir l'estabilitat de les VEs i possibilitar la seva aplicació clínica. La càrrega eficient de material genètic continua sent un desafiament, amb poques investigacions sobre tècniques efectives, mentre que la informació confusa en la literatura impedeix encara més el seu progrés. Abordar aquestes llacunes és fonamental per desbloquejar el potencial clínic de les VEs com a sistemes d’alliberament terapèutics.

Aquesta tesi té com a objectiu avançar en el camp de la recerca de les VEs abordant limitacions clau en la seva caracterització, emmagatzematge i aplicació funcional com a sistemes naturals de lliurament de gens. Mitjançant la implementació d'un conjunt de tècniques complementàries per a la caracterització biofísica i bioquímica de les VEs, s'estableix una plataforma de caracterització robusta dins la nostra institució. Per afrontar el repte de l'emmagatzematge de VEs, es desenvolupa un nou mètode de liofilització, amb l'objectiu de preservar les característiques biofísiques i bioquímiques de les VEs al llarg del temps. Les VEs liofilitzades conserven la seva distribució de mida, morfologia, puresa i funcionalitat, reforçant així el seu potencial com a producte clínic “llest per utilitzar”. Finalment, aquesta tesi explora la càrrega exògena de mRNA en VEs, un pas clau per crear un sistema de lliurament basat en ARN eficient. Es comparen cinc mètodes comuns de càrrega de mRNA, destacant el congelació-descongelació com el més efectiu. Les discrepàncies en l'eficiència de càrrega i lliurament entre els mètodes s'haurien d'estudiar més a fons per millorar la funcionalitat de les VEs. Tot i així, la proporció de VEs carregades aconseguida amb aquests mètodes proporciona una base prometedora per al desenvolupament continu.

En resum, aquesta tesi estableix metodologies essencials per a la investigació de VEs, incloent tècniques rigoroses de caracterització, un protocol d’emmagatzematge adequat i una estratègia de càrrega de mRNA efectiva. Aquests avenços pretenen contribuir a apropar les VEs a futures aplicacions clíniques.

Las vesículas extracelulares (VEs) son cada vez más reconocidas por su potencial como sistemas naturales de administración de fármacos o genes en aplicaciones terapéuticas. Sin embargo, los avances en su manipulación, aislamiento y caracterización no han evolucionado en paralelo con este interés. La falta de protocolos estandarizados para el aislamiento y caracterización de VEs afecta tanto la calidad como la producción de VEs, comprometiendo la fiabilidad experimental. Además, la investigación sobre las condiciones óptimas de almacenamiento es limitada, lo cual es crucial para mantener la estabilidad de las VEs y posibilitar su aplicación clínica. La carga eficiente de material genético sigue siendo un desafío, con pocos estudios sobre técnicas efectivas, mientras que la información confusa en la literatura dificulta aún más su progreso. Abordar estas lagunas es fundamental para desbloquear el potencial clínico de las VEs como sistemas de administración terapéuticos.

Esta tesis tiene como objetivo avanzar en el campo de la investigación de VEs abordando limitaciones clave en su caracterización, almacenamiento y aplicación funcional como sistemas naturales de entrega de genes. A través de la implementación de un conjunto de técnicas complementarias para la caracterización biofísica y bioquímica de las VEs, se establece una plataforma de caracterización robusta dentro de nuestra institución. Para abordar el desafío del almacenamiento de VEs, se desarrolla un novedoso método de liofilización, orientado a preservar las características biofísicas y bioquímicas de las VEs a lo largo del tiempo. Las VEs liofilizadas mantienen su distribución de tamaño, morfología, pureza y funcionalidad, respaldando su potencial como producto clínico “listo para usar”. Finalmente, esta tesis explora la carga exógena de mRNA en VEs, un paso crítico hacia la creación de un sistema de entrega de ARN eficiente. Se comparan cinco métodos comunes de carga de mRNA, destacando la congelación-descongelación como el más efectivo. Las discrepancias en la eficiencia de carga y entrega entre los métodos deben estudiarse más a fondo para mejorar la funcionalidad de las VEs. No obstante, la proporción de VEs cargadas alcanzada con estos métodos proporciona una base prometedora para el desarrollo continuo.

En resumen, esta tesis establece metodologías esenciales para la investigación de VEs, que incluyen técnicas rigurosas de caracterización, un protocolo de almacenamiento adecuado y una estrategia de carga de mRNA efectiva. Estos avances pretenden contribuir a acercar las VEs a futuras aplicaciones clínicas.

Extracellular vesicles (EVs) are increasingly recognized for their potential as natural drug or gene delivery systems (DDS) in therapeutic applications. However, advancements in their manipulation, isolation, and characterization have not evolved in parallel with this interest. The lack of standardized protocols for EV isolation and characterization affects both the quality and consistency of EV production, thus compromising experimental reliability. Additionally, research on optimal storage conditions is limited, which is crucial for maintaining EV stability and enabling their transference to clinical applications. Efficient loading of genetic material is essential for their use as gene delivery systems, however, mRNA loading into EVs remains a challenge. Few studies have reported effective techniques, while misleading information in the literature further impedes progress towards developing reliable mRNA-EV-based delivery systems. Addressing these gaps is essential for unlocking the clinical potential of EVs as therapeutic DDS.

This thesis aims to advance the field of EV research by addressing key limitations in their characterization, storage and functional application as natural gene delivery systems. By implementing a suite of complementary techniques for the biophysical and biochemical characterization of EVs, a robust characterization platform is established within our institution. To address the challenge of EV storage, a novel freeze-drying method is developed, aimed at preserving EV biophysical and biochemical characteristics over time. Freeze-dried EVs retain their size distribution, morphology, purity and functionality, supporting their potential as a “ready-to-use” clinical product. Finally, this thesis explores exogenous mRNA loading into EVs, a critical step toward creating an efficient RNA-based delivery system. Five common mRNA loading methods are compared, with freeze-thaw emerging as the most effective. Discrepancies in loading and delivery efficiencies across methods should be further studied in order to improve EVs functionality. Nevertheless, the proportion of loaded EVs achieved with these methods provides a promising basis for continued development.

In summary, this thesis establishes essential methodologies for EV research, including rigorous characterization techniques, a suitable storage protocol, and an effective mRNA loading strategy. These advancements aim to contribute toward bringing EVs closer to future clinical applications.