Towards polyhydroxyalkanoates synthesis with mixed microbial communities: exploring the uncoupled feeding strategy

Abstract

El plàstic ha satisfet les necessitats de la nostra societat i ha revolucionat les nostres vides. No obstant això, prové de fonts fòssils finites i destinades a esgotar-se. La seva producció massiva, característiques intrínseques i mala gestió han causat conseqüències globals. En aquest context, els bioplàstics han sorgit com una alternativa més sostenible, oferint propietats similars però amb l’avantatge de ser biodegradables o biobasats. Aquesta tesi se centra en la producció de polihidroxialcanoat (PHA), bioplàstic biodegradable i biobasat, produït a partir de residus líquids mitjançant cultius microbians mixtos (MMC). Aquest procés converteix els residus en un producte valuós. No obstant això, la tecnologia encara és immadura, continua sent costosa i ineficient. En particular, el consum d’energia és alt i la productivitat baixa. El PHA és un grup de polímers produït per molts bacteris com a reserva energètica en resposta a l’estrès (per exemple, osmòtic) o condicions de creixement desequilibrades. L’estratègia de selecció de feast i famine alterna entre fases on el carboni està disponible (feast) i on està absent (famine). Si la fase de famine és prou llarga, s’afavorirà els bacteris que emmagatzemen carboni durant la feast. Aquest estudi s’ha centrat en l’estratègia d’alimentació desacoblada, on el carboni es dosifica en la feast i els nutrients en la famine. Aquest enfocament no només fomenta l’acumulació, sinó que també promou el creixement dels bacteris PHA-acumuladors. Els experiments es van realitzar en reactors seqüencials per lots (SBR), amb aigua residual sintètica, que contenia acetat i propionat. Aquesta barreja d’àcids grassos volàtils es va triar per produir potencialment poli(3-hidroxibutirat-co-3-hidroxivalerat), un polímer de major qualitat. El monitoratge es va dur a terme a diversos nivells: un enfocament diari amb mesuraments d’oxigen dissolt (DO) i pH, i anàlisis més complets dels compostos clau (PHA, biomassa, nutrients i carboni) al llarg de cicles individuals. L’anàlisi molecular va ser crucial per comprendre les dinàmiques microbianes i els temps d’estabilització. A més, la microscòpia electrònica de transmissió (TEM) va proporcionar una visualització directa de les inclusions de PHA dins de les cèl·lules bacterianes. Els experiments inicials es van centrar en la variació de paràmetres crítics, com la limitació de nutrients (de la limitació de nitrogen a la de fòsfor) i la durada del famine. Aquests paràmetres, rellevants en l’alimentació “acoblada”, també van demostrar ser importants en el sistema desacoblat. Les característiques del fang activat van emergir, com la presència de bacteris filamentosos i depredadors. Basat en aquests descobriments, es va realitzar un experiment per reduir el consum d’energia i millorar l’acumulació, minimitzant l’airejat i reduint l’activitat dels depredadors. L’experiment va introduir una famine microaerofílica (0-1 mg DO/L) al lloc de les condicions aeròbiques tradicionals. L’acumulació de PHA en aquesta configuració va assolir un màxim del 82% del pes de la biomassa, superant el rendiment del reactor de control (55%). No obstant això, la qualitat del polímer va ser inferior en condicions microaerofíliques. També es va explorar l’efecte de la salinitat en la selecció de bacteris PHA-acumuladores. La majoria dels reactors van operar sota salinitat lleugera (5 g NaCl/L), excepte per un experiment sota condicions hipersalines, 107 g NaCl/L, la salinitat més alta aplicada en un procés de producció de PHA. Les comunitats microbianes es van seleccionar a partir d’inòculs aclimatats a aquestes salinitats. Aquelles cultivades a 5 g NaCl/L es van originar en fangs activats d’una planta de tractament d’aigües residuals d’adoberia, mentre que la comunitat hipersalina es va enriquir a partir de sediments i aigua recollits d’una salina. L’experiment en condicions hipersalines va demostrar ser adequat per promoure el creixement d’una comunitat PHA-acumuladora, amb una acumulació màxima del 44%.

El plástico ha satisfecho las necesidades de nuestra sociedad y revolucionado nuestras vidas. Sin embargo, proviene de fuentes fósiles finitas y destinadas a agotarse. Su producción masiva, características intrínsecas y mala gestión han causado consecuencias globales. En este contexto, los bioplásticos han surgido como una alternativa más sostenible, ofreciendo propiedades similares pero con la ventaja de ser biodegradables o biobasados. Esta tesis se centra en la producción de polihidroxialcanoato (PHA), bioplástico biodegradable y biobasado, producido a partir de residuos líquidos mediante cultivos microbianos mixtos (MMC). Este proceso convierte los residuos en un producto valioso. Sin embargo, la tecnología aún es inmadura, sigue siendo costosa e ineficiente. En particular, el consumo de energía es alto y la productividad baja. El PHA es un grupo de polímeros producido por muchas bacterias como reserva energética en respuesta al estrés (por ejemplo, osmótico) o condiciones de crecimiento desequilibradas. La estrategia de selección de feast y famine alterna entre fases donde el carbono está disponible (feast) y donde está ausente (famine). Si la fase de famine es suficientemente larga, se favorece a las bacterias que almacenan carbono durante la feast. Este estudio se ha centrado en la estrategia de alimentación desacoplada, donde el carbono se dosifica en la feast y los nutrientes en la famine. Este enfoque no solo fomenta la acumulación, sino que también promueve el crecimiento de las bacterias PHA-acumuladoras. Los experimentos se realizaron en reactores secuenciales por lotes (SBR), con agua residual sintética, que contenía acetato y propionato. Esta mezcla de ácidos grasos volátiles se eligió para producir potencialmente poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato), un polímero de mayor calidad. El monitoreo se llevó a cabo a varios niveles: un enfoque diario con mediciones de oxígeno disuelto (DO) y pH, y análisis más completos de los compuestos clave (PHA, biomasa, nutrientes y carbono) a lo largo de ciclos individuales. El análisis molecular fue crucial para comprender las dinámicas microbianas y los tiempos de estabilización. Además, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporcionó una visualización directa de las inclusiones de PHA dentro de las células bacterianas. Los experimentos iniciales se centraron en la variación de parámetros críticos, como la limitación de nutrientes (de la limitación de nitrógeno a la de fósforo) y la duración del famine. Estos parámetros, relevantes en la alimentación "acoplada", también demostraron ser importantes en el sistema desacoplado. Las características del lodo activado emergieron, como la presencia de bacterias filamentosas y depredadores. Basado en estos hallazgos, se realizó un experimento para reducir el consumo de energía y mejorar la acumulación, minimizando la aireación y reduciendo la actividad de los depredadores. El experimento introdujo una famine microaerofílica (0-1 mg DO/L) en lugar de las condiciones aeróbicas tradicionales. La acumulación de PHA en esta configuración alcanzó un máximo del 82% del peso de la biomasa, superando el rendimiento del reactor de control (55%). Sin embargo, la calidad del polímero fue inferior en condiciones microaerofílicas. También se exploró el efecto de la salinidad en la selección de bacterias PHA-acumuladoras. La mayoría de los reactores operaron bajo salinidad ligera (5 g NaCl/L), excepto por un experimento bajo condiciones hipersalinas, 107 g NaCl/L, la salinidad más alta aplicada en un proceso de producción de PHA. Las comunidades microbianas se seleccionaron a partir de inóculos aclimatados a estas salinidades. Aquellas cultivadas a 5 g NaCl/L se originaron en lodos activados de una planta de tratamiento de aguas residuales de curtiduría, mientras que la comunidad hipersalina se enriqueció a partir de sedimentos y agua recogidos de una salina. El experimento en condiciones hipersalinas demostró ser adecuado para promover el crecimiento de una comunidad PHA-acumuladora, con una acumulación máxima del 44%.

Plastic has addressed the needs of the society and revolutionised human lives. However, it comes from finite fossil sources destined for depletion and its massive production, intrinsic characteristics, and poor management have caused global consequences. In this context, bioplastics have emerged as a more sustainable alternative to fossil-based plastics, offering similar properties but with the advantage of being biodegradable or bio-based. This thesis focuses on the production of polyhydroxyalkanoate (PHA), a biodegradable and bio-based bioplastic produced from liquid waste using mixed microbial cultures (MMC) enriched with PHA-accumulating bacteria. This process converts waste into a valuable product; however, the technology is still immature, remaining costly and inefficient. Specifically, energy consumption is still high, and productivity remains low. The selective techniques used to enrich PHA-accumulating communities are inspired by the natural processes. In nature, PHA is a group of polymers produced by many bacteria as energy reserve in response to stress (e.g., osmotic) or unbalanced growth conditions. The feast an famine selection strategy alternates between phases when carbon is available (feast) and absent (famine). If the famine phase is sufficiently long, it favours bacteria that store carbon during the feast. This study has focused on uncoupled feeding strategy, where carbon is dosed at the beginning of the feast and nutrients at the beginning of the famine. This approach not only encourages accumulation during feast but also enhances the growth of PHA-accumulating bacteria by providing nutrients only after carbon has been consumed or converted into PHA. The experiments were conducted using sequencing batch reactors (SBRs), with a synthetic fermented wastewater, containing acetate and propionate. This mix of volatile fatty acids was chosen to potentially produce of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV), a higher quality polymer. Monitoring was conducted at multiple levels: a daily approach using dissolved oxygen (DO) and pH measurements, and more comprehensive analyses of key compounds (PHA, biomass, nutrients and carbon) over individual cycles. Molecular analysis were crucial for understanding microbial dynamics and stabilization times. Additionally, transmission electron microscopy (TEM) provided direct visualisation of PHA inclusions within bacteria cells. Initial experiments focused on varying potentially critical parameters, such as nutrient limitation (switching from nitrogen to phosphorus limitation) and famine duration. These parameters, relevant in “coupled” feeding, also proved important in the uncoupled system. The activated sludge characteristics emerged such as the presence of filamentous bacteria, predators and biofilm formation. Based on these findings, an experiment was conducted to reduce energy consumption and improve accumulation, by minimising aeration and reducing predator activity. The experiment introduced a microaerophilic famine (0-1 mg DO/L) instead of traditional aerobic conditions. The PHA accumulation in this setup reached a maximum of 82% of the biomass weight, surpassing the performance of the control reactor (55%). In terms of productivity, the two selective strategies were found to be comparable. However, the quality of the polymer was found to be lower in microaerophilic conditions. The effect of salinity on the selection of PHA-accumulating bacteria was also explored, as osmotic stress can promote the growth of such organism. Most reactors operated under light salinity (5 g NaCl/L), except for one experiment under hypersaline conditions, 107 g NaCl/L, the highest salinity ever applied to PHA production process. The microbial communities were selected from inocula acclimated to these salinities. Those cultivated at 5 g NaCl/L originated from activated sludge from a tannery wastewater treatment plant, while the hypersaline community was enriched from sediments and water collected from a salt pan. The experiment under hypersaline conditions proved to be suitable for promoting the growth of a PHA-accumulating community, with a maximum accumulation of 44% of the biomass weight.