Research and development of a new biocontrol agent against the foliar diseases downy and powdery mildews in cucurbit crops

Abstract

[eng] This doctoral thesis explores the initial phases of the development of a new phytosanitary product aimed at combating fungal diseases mildew (Pseudoperonospora cubensis) and powdery mildew (Podosphaera fusca) in cucurbit crops. The study began with the isolation and pre-selection of microbial species from different places and types of plants affected by one of these two diseases. This phase concluded with 724 microbial isolates (491 bacteria and 233 fungi). The selected strains were subjected to molecular screening for taxonomic classification by sequencing the 16S rRNA gene in bacteria and the ITS region in fungi. This process led to the identification of 128 bacterial strains of the desired group and 11 strains of the fungal species of interest. Efficacy trials against both pathogens, carried out under controlled conditions in cucumbers, showed that several isolates significantly reduced the severity of the disease. The most effective strains against one disease also showed high efficacy against the other. Among these, some strains of bacteria obtained the best preventive efficacy in both pathosystems and were selected for subsequent studies. In contrast, yeasts proved to be more effective as curative treatments for powdery mildew. The safety assessments of the five most effective strains were carried out based on the bioinformatics study of genome sequencing in accordance with EU regulatory requirements. Finally, only two bacterial strains were selected for further analysis as the most promising candidates. Their safety profiles were confirmed based on their taxonomic classification, the absence of plasmids or genetic motility elements associated with antimicrobial resistance, the lack of toxin genes or virulence factors, and the absence of dangerous metabolites. In addition, genes involved in the synthesis of beneficial secondary metabolites, such as surfactin and phengicin, were found in their genomes, which are very important for the efficacy of biocontrol. The production of these lipopeptides, along with other secondary metabolites, was subsequently validated by LC-QTOF-MS/MS analysis. In addition, in the evaluation of biofilm formation and leaf permanence, one of the two strains showed a superior biofilm formation capacity and environmental adaptability, especially in outdoor conditions, suggesting a greater potential for application in the field. Scanning electron microscopy also confirmed that this same strain formed more homogeneous biofilms with a mucous texture than the other previously selected strain. In summary, this work underlines the potential of biocontrol agents in sustainable agriculture, presenting the strain finally selected, based on a collection of 724 isolates, as a leading candidate for biocontrol products intended for the management of downy mildew and powdery mildew in cucurbits and possibly in other crops.

[cat] Aquesta tesi doctoral explora les fases inicials del desenvolupament d’un nou producte fitosanitari destinat a combatre les malalties fúngiques míldiu (Pseudoperonospora cubensis) i oïdi (Podosphaera fusca) en cultius de cucurbitàcies. L’estudi va començar amb l’aïllament i la preselecció d’espècies microbianes de diferents llocs i tipus de plantes afectades per una d’aquestes dues malalties. Aquesta fase va concloure amb 724 aïllats microbians (491 bacteris i 233 fongs). Les soques seleccionades es van sotmetre a un cribratge molecular per a la classificació taxonòmica mitjançant la seqüenciació del gen 16S rRNA en bacteris i de la regió ITS en fongs. Aquest procés va conduir a la identificació de 128 soques bacterianes del grup desitjat i 11 soques de les espècies fúngiques d’interès. Els assaigs d'eficàcia contra ambdós patògens, realitzats en condicions controlades en cogombres, van mostrar que diversos aïllats reduïen significativament la gravetat de la malaltia. Les soques més efectives contra una malaltia també van mostrar una alta eficàcia contra l'altra. Entre aquestes, algunes soques de bacteris van obtenir la millor eficàcia preventiva en ambdós patosistemes i van ser seleccionades pels estudis posteriors. En canvi, els llevats van demostrar ser més efectius com a tractaments curatius per a l’oïdi. Les avaluacions de seguretat de les cinc soques més efectives es van dur a terme basant-se en l'estudi bioinformàtic de la seqüenciació del genoma d'acord amb els requisits normatius de la UE. Finalment, només dues soques bacterianes van ser seleccionades per a una anàlisi posterior com els candidats més prometedors. Els seus perfils de seguretat es van confirmar basant-se en la seva classificació taxonòmica, l'absència de plasmidis o elements genètics de mobilitat associats a resistències antimicrobianes, la manca de gens de toxines o factors de virulència i l'absència de metabòlits perillosos. A més, es van trobar en els seus genomes gens implicats en la síntesi de metabòlits secundaris beneficiosos, com la surfactina i la fengicina, que són molt importants per a l'eficàcia del biocontrol. La producció d'aquests lipopèptids, juntament amb altres metabòlits secundaris, es va validar posteriorment mitjançant una anàlisi LC-QTOF-MS/MS. A més, en l’avaluació de la formació de biofilm i la permanència en fulla, una de les dues soques va mostrar una capacitat superior de formació de biofilm i adaptabilitat ambiental, especialment en condicions a l'exterior, cosa que suggereix un major potencial d'aplicació en camp. La microscòpia electrònica d’escaneig va confirmar a més que aquesta mateixa soca formava biofilms més homogenis i de textura mucosa que l’altra soca prèviament seleccionada. En resum, aquest treball subratlla el potencial dels agents de biocontrol en l’agricultura sostenible, presentant la soca finalment seleccionada, partint d’una col·lecció de 724 aïllats, com una candidata destacada per a productes de biocontrol destinats al maneig del míldiu i l’oïdi en cucurbitàcies i possiblement en altres cultius.