Improving genetic diagnosis of hereditary myopathies by integrating transcriptome, genome sequencing and reanalysis

Abstract

Les miopaties hereditàries són un grup de malalties neuromusculars causades per defectes al múscul esquelètic. Aquestes malalties presenten una heterogeneïtat clínica, i genètica que complica l’obtenció d’un diagnòstic precís. Tot i els avenços de la Seqüenciació de Segona Generació (Next Generation Sequencing, NGS), la meitat dels pacients amb miopaties hereditàries no obtenen un diagnòstic genètic després dels estudis a nivell assistencial. Per aquests pacients, la identificació del defecte molecular és essencial per a establir una correcta progressió de la malaltia, accedir a tractaments, i rebre un assessorament genètic i reproductiu adient. Diferents factors poden explicar la dificultat d’obtenir un diagnòstic molecular, incloent: la identificació d'un gran nombre de variants de significat clínic incert (VUS) en els estudis de seqüenciació massiva, el defecte molecular no és capturat durant la seqüenciació de l’exoma, o bé el gen associat amb la malaltia encara no ha estat descrit, entre d’altres. A aquesta tesi s’ha aplicat una estratègia multiòmica incorporant l’anàlisi de l’ARN muscular, i el reanàlisi de dades genètiques prèvies en 79 casos sense un diagnòstic genètic definitiu després d’un primer estudi d’NGS. A més, també s’ha fet seqüenciació del genoma complet en una selecció de casos. Aquests estudis han permès identificar el defecte molecular en 27 de 79 pacients, representant un augment en la taxa diagnòstica del 34.2%. La primera publicació inclosa en aquesta tesi, estudia pacients amb distrofinopatia diagnosticada segons la presentació clínica i l’anatomopatologia. Tot i això, els estudis genètics estàndards incloent MLPA del gen DMD i NGS, no han identificat cap variant patogènica en aquests pacients. L’anàlisi de l’ARN muscular ha identificat una alteració transcriptòmica a tots aquests casos, sent la inclusió d’un pseudoexó l’alteració patogènica més comuna. Aquests resultats posen de manifest la necessitat i la utilitat de realitzar estudis transcriptòmics addicionals en aquests pacients. A la segona publicació, s’ha dut a terme la seqüenciació de l'ARN (RNAseq) muscular en 70 casos sense diagnòstic genètic. En total, l'RNAseq ha permès identificar el defecte molecular en 10 de 70 pacients (14.3%), mentre que la reanàlisi de dades genòmiques prèvies ha permès arribar al diagnòstic en 9/70 casos (12.9%). Una anàlisi de benchmarking de les eines bioinformàtiques de detecció de splicing aberrant ha permès identificar que FRAESR i FRASER2, d'acord amb la nostra cohort, són eines superiors a LeafCutterMD i rMATS-turbo. Finalment, la publicació 3 descriu una nova forma autosòmica dominant associada a una variant fundadora al gen RYR1 a la població del País Basc. En set famílies, aquesta variant s’associa a alts nivells de creatina quinasa, una debilitat muscular no progressiva i miàlgia. En resum, aquest treball ha contribuït en la identificació dels mecanismes moleculars subjacent les miopaties hereditàries, recalca la utilitat de tecnologies òmiques complementàries per interpretar variants de significat clínic incert, i millora el diagnòstic d’aquestes malalties. Hem demostrat que l’anàlisi de l’ARN és particularment útil en dos escenaris. Primer, en detectar variants en trans en individus amb una sola variant patogènica en heterozigosi, i, segon, en casos amb gens candidats d'acord amb la presentació clínica, com per exemple, les distrofinopaties o la distròfia muscular causada per defectes al col·lagen-VI. Aquest treball també ha permès confirmar que la combinació genòmica i transcriptòmica incrementa la probabilitat d’obtenir un diagnòstic genètic definitiu i accelera el temps d’identificació de variants causals de malaltia. En conjunt, aquestes anàlisis han contribuït a posar fi a l’odissea diagnòstica d’alguns pacients, i ha permès obtenir un coneixement més profund de les bases moleculars de les miopaties hereditàries gràcies a la identificació de nous gens candidats causals de malaltia, la identificació de nous mecanismes moleculars i l’expansió fenotípica de malalties ja conegudes.

Las miopatías hereditarias son un grupo de enfermedades neuromusculares causadas por defectos en el músculo esquelético. Estas enfermedades presentan una heterogeneidad clínica y genética que complica la obtención de un diagnostico genético preciso. Aún con los grandes avances en las tecnologías de secuenciación de segunda generación (NGS), la mitad de los pacientes con miopatías hereditarias no obtienen un diagnóstico genético después de estudiarse a nivel asistencial. Para estos pacientes, identificar el defecto molecular es esencial para establecer una correcta progresión de la enfermedad, acceder a tratamientos, y recibir un asesoramiento genético y reproductivo. Distintos factores pueden explicar la dificultad en la obtención de un diagnóstico molecular, incluyendo la identificación de un gran número de variantes significado clínico inciertos (VUS) en los estudios de secuenciación masiva, que el defecto molecular no es capturado durante la secuenciación del exoma o bien que el gen asociado con la enfermedad aún no ha sido descrito, entre otros. En esta tesis se ha aplicado una estrategia multiómica incorporando el análisis del ARN muscular, y el reanálisis de datos genéticos previos en 79 pacientes sin un diagnóstico genético definitivo después de un primer estudio de NGS. Además, también se ha realizado la secuenciación de genoma completo en una selección de casos. Estos estudios han permitido la identificación del defecto molecular en 27 de 79 pacientes, representando un aumento en la tasa diagnóstica del 34.2%. La primera publicación incluida en la tesis, estudia pacientes con distrofinopatía diagnosticada en base a la presentación clínica i anatomopatológica. Aun así, los estudios genéticos estándar incluyendo MLPA del gen DMD y NGS, no han identificado ninguna variante patogénica en estos pacientes. El análisis del ARN muscular ha identificado una alteración transcriptómica en todos los casos estudiados, siendo la inclusión de un pseudoexón la alteración patogénica más frecuente. Estos resultados resaltan la necesidad y utilidad de realizar estudios transcriptómicos adicionales en estos pacientes. En la segunda publicación se ha secuenciado el ARN muscular (RNAseq) en 70 pacientes sin diagnóstico genético tres el estudio a nivel asistencial. En total, el RNAseq ha permitido identificar el defecto molecular en 10 de 70 pacientes (14.3%), mientras que el reanálisis de datos genómicos previos ha permitido llegar al diagnóstico en 9/70 casos (12.9%). Finalmente, la publicación 3 describe una nueva forma autosómica dominante asociada a una variante fundadora en el gen RYR1 en la población del País Vasco. En siete familias, esta variante se asocia a altos niveles de creatina quinasa, una debilidad muscular no progresiva y mialgia. En resumen, este trabajo ha contribuido en la identificación de mecanismos moleculares subyacentes de las miopatías hereditarias, recalca la utilidad de tecnologías ómicas complementarias para interpretar variantes de significado clínico incierto, y mejora el diagnóstico de estas enfermedades. Hemos demostrado que el análisis del ARN es particularmente útil en dos escenarios. Primero, al detectar variantes en trans en individuos con una sola variante patogénica en heterocigosis, y, segundo, en casos con genes candidatos de acuerdo con la presentación clínica, como por ejemplo, las distrofinopatías o la distrofia muscular causada por defectos en el colágeno-VI. Este trabajo también ha permitido confirmar que la combinación genómica y transcriptómica incrementa la probabilidad de obtener un diagnóstico genético definitivo y acelera el tiempo de identificación de variantes causales de enfermedad. En conjunto, estos análisis han contribuido a poner fin a la odisea diagnóstica de algunos pacientes, y ha permitido obtener un conocimiento más profundo de las bases moleculares de las miopatías hereditarias gracias a la identificación de nuevos genes candidatos causales de enfermedad, la identificación de nuevos mecanismos moleculares y la expansión fenotípica de enfermedades ya conocidas.

Hereditary myopathies are a group of neuromuscular diseases primarily caused by defects in the skeletal muscle. These conditions show high clinical and genetic heterogeneity, which complicates reaching a precise diagnosis. Despite the advances with the implementation of Next Generation Sequencing (NGS), half of the patients with hereditary myopathies do not have a definitive genetic diagnosis after clinical genetic testing. Pinpointing the molecular defect is crucial for establishing disease prognosis and access to treatments, as well as receiving accurate genetic and reproductive counselling. Several factors can explain the difficulty in reaching a precise molecular diagnosis, including: many variants of uncertain significance are identified, the molecular defect is not captured in exome sequencing (ES), or the gene associated with the disease has not been described to date, among others. In this thesis, we applied a stepwise multiomics strategy involving muscle RNA analysis and genetic reanalysis in 79 cases where a definitive genetic diagnosis was not established after the first NGS study. In addition, we performed genome sequencing on selected cases. These studies established the genetic cause in 27 out of 79 patients, representing a diagnostic yield of 34.2%. The first publication included in this thesis focuses on seven dystrophinopathy cases with clear clinical and anatomopathological indications. However, standard genetic testing, including MLPA and ES, did not identify pathogenic variants in these patients. Muscle RNA analysis of the DMD gene showed an alteration in all studied cases, with pseudoexon inclusion being the most common pathogenic alteration. These results highlighted the need to perform additional transcriptomic studies in undiagnosed dystrophinopathy patients. In the second publication, muscle RNA sequencing was performed in 70 undiagnosed cases with muscular dystrophies or myopathies. RNAseq established a molecular diagnosis in 10/70 (14.3%) patients, while reanalysis of the first NGS test allowed the diagnosis of 9/70 (12.9%) individuals. Seven cases (10%) are still under study since we have identified candidate variants in neuromuscular genes, an OMIM gene with an expanded phenotype and candidate non-OMIM genes highly expressed in skeletal muscle. In addition, a benchmarking of aberrant splicing detection tools was performed in this cohort, and based on our data, FRASER and FRASER2 outperformed LeafCutterMD and rMATS-turbo. Finally, publication 3 describes a novel autosomal dominant RYR1 founder variant in the Basque population. We showed that the p.Leu2286Val variant is associated with nonprogressive muscle weakness, high CK levels and myalgia in seven families. Overall, this work contributes to identifying the molecular mechanisms underlying muscle diseases, highlights the utility of complementary omic technologies in interpreting variants of uncertain significance, and improves the diagnosis of hereditary myopathies. We have shown that muscle RNA analysis is instrumental in two scenarios. First, to detect an in trans variant in cases with a single heterozygous pathogenic variant; and second, in cases with strong candidate gene(s) based on clinical presentation, such as dystrophinopathies or COL6-related dystrophies. We also show that the combination of genomics and transcriptomics increases the success rate and accelerates turnaround times to identify causative variants. Altogether, these analyses have contributed to put an end to the patients’ diagnostic odyssey, and have provided a deeper understanding of the molecular basis of hereditary myopathies through the discovery of novel candidate genes, new disease mechanisms and the phenotypic expansion of known conditions.