Dissecting the role of BR receptor BRL3-mediated ROS signaling for plant adaptation to abiotic stress

Abstract

Aquesta tesi doctoral presenta nous descobriments sobre la interacció entre les vies de senyalització de les brasinoesteroides (BRs) i les espècies reactives d’oxigen (ROS) a Arabidopsis thaliana, així com una perspectiva evolutiva sobre la família de factors de transcripció WOX en la regulació de la dinàmica del meristema a la briòfita Marchantia polymorpha.

Les BRs són hormones esteroides vegetals que controlen el creixement i desenvolupament general de la planta, i tenen un paper clau en l’adaptació als entorns canviants. Les BRs són percebudes per la família de receptors tipus BRI1, essent BRI1 el més caracteritzat. Hi ha dos homòlegs, BRL1 i BRL3, que també poden reconèixer la brassinolida (BL) i iniciar la senyalització mediada per BR. Ambdós s’expressen al nínxol de cèl·lules mare i al sistema vascular. En particular, BRL3 s’ha relacionat estretament amb les respostes a estrès abiòtic com la termomorfogènesi, l’estrès osmòtic i la sequera.

Mitjançant anàlisis proteòmiques i transcriptòmiques, aquest treball revela un nou paper de BRL3 en la senyalització de ROS. En concret, s’identifica l’homòleg D de l’oxidasa de l’esclat respiratori (RBOHD), una de les principals enzimes productores de ROS a l’apoplast, com a part del complex de BRL3. Aquesta interacció apunta a una connexió directa entre les vies de BR i ROS a nivell del receptor. Amb un enfocament interdisciplinari que combina genètica, biologia molecular, bioquímica, tècniques d’imatge i fisiologia, demostrem que les vies de senyalització de BR i ROS actuen de manera sinèrgica per afavorir el desenvolupament vegetal i l’adaptació a l’estrès.

Aquesta tesi explora específicament com BRL3 regula RBOHD tant a nivell transcripcional com posttraduccional. Les anàlisis bioquímiques mostren una interacció constitutiva entre BRL3 i RBOHD, essencial per a la producció de ROS induïda per BR a l’arrel d’Arabidopsis. A més, les dades obtingudes a nivell cel·lular i fisiològic indiquen que la proteïna RBOHD juga un paper clau en l’estabilitat dels receptors BRI1 i BRL3, afectant així el desenvolupament de la planta i les respostes a l’estrès abiòtic. Els nostres resultats donen suport a un model en què BRI1 regula el creixement general de la planta, mentre que BRL3 governa les respostes a l’estrès, amb la producció de ROS mediada per RBOHD com a component essencial en ambdós complexos de senyalització.

Paral·lelament, mitjançant un enfocament de biologia evolutiva del desenvolupament, hem descobert la funció conservada del membre homòleg WOX, MpWOX, a Marchantia polymorpha, en el context del control de la dinàmica del meristema. MpWOX mostra una expressió enriquida a la zona que envolta l’entaulament apical del tàl·lus, concretament a la regió ventral. Amb l’ajuda d’eines d’imatge i anàlisis bioinformàtiques, s’ha estudiat en detall el paper d’aquest factor de transcripció en la zona de divisió activa del meristema, destacant la seva rellevància en la seva regulació.

En conjunt, aquesta tesi doctoral aporta una millor comprensió de com components específics asseguren el desenvolupament vegetal i l’adaptació a l’entorn. En particular, s’afegeix una nova capa de coneixement sobre la senyalització mediada pel receptor esteroide BRL3 en cèl·lules específiques, descrivint la seva interacció i mecanisme amb RBOHD. Un altre avenç clau ha estat aprofundir en els mecanismes evolutius que regulen els meristemes vegetals, estructures essencials per mantenir la integritat de l’organisme. Aquest treball ofereix noves perspectives i obre múltiples línies de recerca per entendre com components localitzats amb precisió poden activar cascades de senyalització que regulen el desenvolupament global de les plantes.

Esta tesis doctoral presenta nuevos hallazgos sobre la interacción entre las rutas de señalización de las brasinoesteroides (BRs) y las especies reactivas de oxígeno (ROS) en Arabidopsis thaliana, así como una perspectiva evolutiva sobre la familia de factores de transcripción WOX en la regulación de la dinámica del meristemo en la briófita Marchantia polymorpha.

Las BRs son hormonas esteroides vegetales que controlan el crecimiento y desarrollo general de la planta, desempeñando un papel clave en la adaptación a entornos cambiantes. Las BRs son percibidas por la familia de receptores similares a BRI1, siendo BRI1 el más ampliamente caracterizado. Existen dos homólogos, BRL1 y BRL3, que también son capaces de reconocer la Brassinólida (BL) e iniciar la señalización mediada por BR. Ambos se expresan en la región del nicho de células madre y en el sistema vascular. En particular, BRL3 ha sido estrechamente vinculado con respuestas a estreses abióticos como la termomorfogénesis, el estrés osmótico y la sequía.

Mediante análisis proteómicos y transcriptómicos, este trabajo revela un nuevo papel para BRL3 en la señalización de ROS. Se identifica al Homólogo D de la Oxidasa del Estallido Respiratorio (RBOHD), una de las principales enzimas productoras de ROS en el apoplasto, como parte del complejo de BRL3. Esta interacción apunta a una conexión directa entre las vías de señalización de BR y ROS a nivel del receptor. Utilizando un enfoque interdisciplinar que combina genética, biología molecular, bioquímica, imagen y fisiología, demostramos que las rutas de BR y ROS actúan de forma sinérgica para apoyar el desarrollo vegetal y la adaptación al estrés.

Esta tesis profundiza específicamente en cómo BRL3 regula a RBOHD tanto a nivel transcripcional como postraduccional. Los análisis bioquímicos revelan una interacción constitutiva entre BRL3 y RBOHD, esencial para la producción de ROS inducida por BR en la raíz de Arabidopsis. Además, los estudios celulares y fisiológicos indican que la proteína RBOHD juega un papel crucial en la estabilidad de los receptores BRI1 y BRL3, lo que repercute en el desarrollo de la planta y en las respuestas al estrés abiótico. Nuestros resultados apoyan un modelo en el que BRI1 regula el crecimiento general de la planta, mientras que BRL3 modula la respuesta al estrés, siendo la producción de ROS mediada por RBOHD un componente esencial en ambos complejos de señalización.

Paralelamente, mediante un enfoque de biología evolutiva del desarrollo, se ha descubierto la función conservada del miembro homólogo WOX, MpWOX, en Marchantia polymorpha, en el contexto del control de la dinámica del meristemo. MpWOX muestra una expresión enriquecida en la zona que rodea la muesca apical del talo, específicamente en la región ventral. Mediante herramientas de imagen y análisis bioinformático, se ha analizado en detalle el papel de este factor de transcripción en la zona de división activa del meristemo, lo que sugiere su relevancia en la dinámica meristemática.

En conjunto, esta tesis doctoral esclarece cómo componentes específicos aseguran el desarrollo vegetal y la adaptación al entorno. En particular, se añade una nueva capa de conocimiento sobre la señalización mediada por el receptor esteroideo BRL3 en células específicas, describiendo su interacción y mecanismo con RBOHD. Otro aporte clave ha sido profundizar en los mecanismos evolutivos que regulan los meristemos vegetales, estructuras esenciales para mantener la integridad del organismo. Este trabajo ofrece nuevas perspectivas y abre múltiples líneas de investigación para comprender cómo componentes localizados de forma precisa pueden activar cascadas de señalización que rigen el desarrollo global de las plantas.

The present PhD thesis dissertation reports new insights for the Brassinosteroids (BRs), and Reactive Oxygen Species (ROS) signaling crosstalk to ensure the plant adaptation to stress in Arabidopsis thaliana and an evolutionary perspective for WOX family of transcription factors in regulating the meristem of the bryophyte Marchantia polymorpha.

Steroid plant hormones, called BRs, control overall growth and development, showing a key role in adaptation to the changing environments. BRs are perceived by Brassinosteroid Insensitive 1 (BRI1)-like family, in which BRI1 is the most characterized receptor. There are two BRI1-like homologues, BRL1 and BRL3, known to be able to recognize Brassinolide (BL) and trigger the BR-mediated cascade; both expressed in the stem cell niche and vasculature. BRL3 mediated signaling has been strongly related to abiotic stress responses, such as thermomorphogenesis, osmotic and drought stress. Our proteomic and transcriptomic analyses reveal a role for BRL3 in ROS signaling, finding Respiratory Oxidase Homologue D (RBOHD), the most studied protein producing ROS in the apoplast, in the BRL3 complex. This interaction points to a direct relation between BR and ROS signaling pathways, focusing specifically on the receptor level. Here, with the use of interdisciplinary methodologies, such as genetics, molecular biology, biochemistry, imaging and physiology, we have uncovered how BR and ROS signaling pathways combine in a synergistic manner to ensure plant development and adaptation. In particular, the work collected in this thesis deciphers the regulation behind the BR and ROS signaling pathways, by specifically studying how the BR receptor BRL3 regulates RBOHD in a transcriptional and posttranslational manner. Moreover, biochemical analyses have revealed the mechanism behind BRL3-RBOHD complex, indicating a constitutive interaction, and is crucial role in BR-mediated ROS in the Arabidopsis root. Additionally, cell biology and physiological approaches suggest the pivotal role of RBOHD protein in the BRI1 and BRL3 receptors stability and, as consequence, mediated traits in plant development and abiotic stress responses. Our results support the model of BRI1 governing the overall plant growth, whereas BRL3 governs stress response, and the requirement of RBOHD-mediated ROS in both complexes to ensure the signal transduction.

On the other hand, through an evolutionary developmental approach, we have uncovered the conservative function of WOX homologue member, MpWOX, in Marchantia polymorpha in the context of controlling the meristem dynamics. MpWOX showed an enriched expression in the area surrounding the apical notch in the thallus, specifically in the ventral zone. Moreover, taking advantage of imaging and bioinformatic tools, the role of this transcription factor in the actively dividing area of the meristem was analyzed in detail, suggesting its relevance in the meristem dynamics.

Overall, the present PhD thesis elucidates how specific components ensure the plant development and adaptation. Specifically, we have added a new layer in the cell-specific steroid receptor BRL3 mediated signaling, by describing its interaction and mechanism with RBOHD. Another key contribution of this thesis has been to delve into the evolutionary mechanisms governing plant meristems, which are crucial for maintaining the integrity of the organism. This work provides novel insights and opens multiple lines of research to uncover how precisely localized components can trigger signaling cascades that govern overall plant development.