The use of omic-methodologies in the assessment of heat-stressed lactating dairy goats

Abstract

L’estrés per calor (EC) genera pèrdues significatives en l’industria lletera caprina quan l’índex de temperatura-humitat (THI) és > 75. Les tecnologies ‘òmiques’ ofereixen una perspectiva holística de com les cabres combaten l’EC i poden permetre trobar biomarcadors. Amb aquest objectiu, es van portar a terme 3 experiments (Exp.) utilitzant cabres lleteres Murciano-Granadines i una càmbra climàtica amb caixes metabòliques. Les cabres lleteres (n = 32) es van alimentar amb una ració total mesclada i es van munyir ⨯1 diàriament sota dos condicions climàtiques. Aquestes foren: TN (termo-neutralitat, THI = 59-65) i EC (dia, THI = 86; nit, THI = 77) amb fotoperíode (llum-foscor) constant (12-12 h). Es van controlar a diari diferents variables fisiològiques i productives, setmanalment la composició de la llet i a l’inici i al final de tots els períodes Exp, el pes corporal. En l’Exp.1, es van estudiar els canvis transcriptòmics en sang de 2 grups de 4 cabres (n = 8) sota TN o EC durant 35 dies. Els microarrays en mostres de sang van revelar que l’EC va augmentar l’expressió de 55 gens i en va reduir la de 88 gens. L’anàlisi Dynamic Impact Approach va indicar 31 rutes biològiques afectades per EC. Els efectes van ésser negatius per a la migració transendotelial dels leucòcits, l’adhesió cel·lular, el llinatge de cèl·lules hematopoiètiques, i la senyalització de Ca i PPAR, mentre que es va activar el metabolisme dels nucleòtids. En conclusió, l’EC va afectar negativament a la producció de llet i va alterar la funcionalitat de les cèl·lules immunitàries, fet que podria resultar en un sistema immunitari amb menor capacitat per combatre malalties. En l’Exp.2, es van avaluar candidats de biomarcadors d’EC en orina mitjançant 1H RMN (Resonància Magnètica Nuclear de protons). Les cabres (n = 16) es van sotmetre a les condicions de TN i EC segons un disseny crossover durant 35 d. Es va emprar un anàlisi de mínims quadrats discriminatoris parcials (PLS-DA) amb validació creuada que va permetre separar els grups TN i EC. Els metabòlits discriminants entre grups van ser derivats tòxics de la fenilalanina (Phe) (OH-fenilacetat, OH-fenilacetilglicina, fenilglioxilat i hipurat) que van augmentar en EC, respecte a TN. Una major excreció d’aquests compostos en orina va indicar que l’EC indueix un sobrecreixement de la microbiota gastrointestinal nociva segrestant els aminoàcids aromàtics de la ració. En consequència, l’EC hauria de disminuir la síntesi de neurotransmissors i hormones tiroidees, abaixant el rendiment i la composició de la llet. En conclusió, la minvada lletera de les cabres EC es va reflexar en el seu metaboloma per la presència de compostos tòxics derivats del tracte gastrointestinal en l’orina. Es van identificar els derivats de Phe i l’hipurat com biomarcadores d’EC en orina de cabres lleteres. En l’Exp.3, les cabres lleteres (n = 8) es van sotmetre a les condicions de TN i EC durant 15 dies i es van avaluar biomarcadors candidats en llet mitjançant 1H RMN. El dia 12, se les va exposar a lipopolisacàrid d’E. coli (LPS) o salí (CON) en una de les mamelles i es varen prendre mostres de llet a les 0, 4, 6, 12 y 24 h. El citrat en llet va augmentar en EC indicant un canvi en la funció mitocondrial dels macròfags (i.e. transport de citrat de la mitocòndria al citosol para produir mediadors inflamatoris). El metaboloma en llet de les mamelles TN-LPS va quedar menys afectat i va recuperar el seu nivell basal en un període més curt que en les mamelles EC-LPS. Els metabòlits discriminants van ésser la colina, els N-acetil-carbohidrats, L-lactat, ß-hidroxibutirat i la fosfocolina. Per tant, el perfil metabolòmic de la llet es va veure molt afectat per les condicions ambientals i de salut de la mamella. El citrat i la colina van indicar l’aparició d’estadis oxidatius e inflamatoris en la glàndula mamària sota EC o LPS, respectivament, pel que es proposen com a biomarcadors en llet.

Heat stress (HS) causes significant losses in the dairy goat industry when temperature-humidity index (THI) is >75. ‘Omic’ technologies offer a holistic approach to figure out how goats cope with HS and to find biomarkers. With this aim, 3 experiments (Exp.) were carried out using Murciano-Granadina dairy goats and a climatic chamber with metabolic boxes. Lactating does (n = 32) were fed a total mixed ration, freely watered and milked ⨯1 daily under different climatic conditions. They were: TN (thermal neutral, THI = 59-65) and HS (day, THI = 86; night, THI = 77). Photoperiod (light-dark) was constant (12-12 h). Physiological and performance traits were recorded daily, milk composition sampled weekly and BW at the start and the end of each Exp. period. In Exp.1, changes in blood transcriptome of 2 groups of 4 does (n = 8), under TN or HS were studied for 35 d. In addition to performance impairment, microarrays of blood samples at d 35, revealed that HS up-regulated 55 genes and down-regulated 88. Dynamic Impact Approach analysis showed 31 biological pathways affected by HS. Effects were negative in these related with leukocyte transendothelial migration, cell adhesion, hematopoietic cell lineage, Ca and PPAR signaling, whereas were positive on those activating nucleotide metabolism. In conclusion, HS worsened milk performances and altered the functionality of immune cells, which may result in a less competent immune system for fending-off diseases. In Exp.2, HS candidate biomarkers in urine were assessed by 1H NMR (proton Nuclear Magnetic Resonance)-based metabolomics. Does (n = 16) were submitted to the TN and HS conditions in a crossover design lasting 35 d. Partial least square-discriminant analysis with cross validation were used to separate between TN and HS clusters. Discriminating metabolites were Phenilalanine (Phe) derivative toxic compounds (OH-phenylacetate, OH-phenylacetylglycine, phenylglyoxylate and hippurate), which increased in HS vs. TN does. Increased urinary excretion of these compounds indicated a harmful gastrointestinal microbiota overgrowth by HS, which sequestrated dietary aromatic amino acids. Consequently, HS does should have decreased the synthesis of neurotransmitters and thyroid hormones, impairing milk yield and composition. In conclusion, lactational impairment of HS does was reflected in their metabolome by the presence of gut-derived toxic compounds in urine. Phe derivatives and hippurate were identified as key urinary biomarkers of HS dairy goats. In Exp.3, lactating dairy goats (n = 8) were submitted to the TN and HS conditions for 15 d and milk candidate biomarkers assessed by 1H NMR. On d 12, does were challenged with E. coli lipopolysaccharide (LPS) or saline (CON) by udder-half and milk samples collected post-challenge (h 0, 4, 6, 12 and 24). Treatments were: TN (CON and LPS) and HS (CON and LPS). Milk citrate increased in HS revealing a shift in macrophages’ function (i.e., transporting mitochondrial citrate to cytosol to produce inflammatory mediators). Differences between TN and HS in response to LPS over time where observed by PLS-DA. Milk metabolome in TN-LPS udder halves was less affected and restored earlier than in HS-LPS halves. Most discriminating metabolites were choline, N-acetylcarbohydrates, L-lactate, ß-hydroxybutyrate (BHBA) and phosphocholine. Overall, milk metabolomic profiles were markedly affected by ambient and udder health conditions. Citrate and choline indicated the occurrence of oxidative and inflammatory stages in HS and LPS stressed mammary glands, respectively, and were proposed as key biomarkers in milk.