Exploring the human tRNAome: From transcriptional and processing dynamics to genomic organization and somatic mutagenesis

Abstract

[eng] Transfer RNAs (tRNAs) play a fundamental role in protein synthesis. They mediate the decoding of messenger RNA into specific amino acids through codon-anticodon interactions, according to the genetic code. The cellular tRNA pool is mainly determined by the transcription rate of tRNA genes (tDNAs), which is governed by many regulatory layers. Besides being transcribed, to be fully active, tRNAs undergo several post-transcriptional processing steps that include the addition of chemical modifications. Alterations in any of those steps have been implicated in diseases such as cancer and neurological disorders. Nevertheless, due to the complexity of tRNA biology, characterizing the cellular tRNA pool is quite complex and is often accompanied by methodological challenges. Therefore, many aspects of tRNA biology remain unknown and require further research to understand their full impact on diseases. For this reason, in this thesis, we focus on the application and development of bioinformatic strategies to decipher different aspects of tRNA biology. Currently, one of the most used techniques for analyzing the tRNA pool is small RNA sequencing (tRNA-Seq). However, the analysis of tRNA-Seq data requires the adaptation of the computational workflow from standard approaches. For this reason, we first developed tRNAstudio, an integrative pipeline that includes a mapping strategy that allows the characterization of tRNA processing and modification landscape, as well as the implementation of tRNA differential expression analysis. All pipeline components were integrated into a graphical user interface (GUI) that eases the analysis of tRNA-Seq data for non-computational users. Next, we focused on the functional relevance of the modification of adenine (A) to inosine (I) at position 34 of tRNA anticodons (I34-tRNAs), a modification crucial for the expansion of the decoding capacity of tRNAs. In Eukarya, this modification is catalyzed by Adenosine Deaminase Acting on tRNA (ADAT), composed of ADAT2 and ADAT3. Mutations in genes encoding ADAT have been associated with neurological disorders. To comprehend the impact of changes in the levels of I34-tRNAs, a knockdown model of ADAT2 (KD) was generated by our group. Using tRNAstudio, we analyzed the impact of ADAT2 KD on the tRNA pool. The results validated the model by verifying a reduction of I34-tRNAs in the context of ADAT2 KD. Moreover, we observed that the cell is unable to compensate for its loss by upregulating the expression of alternative tRNAs, highlighting the critical role of I34-tRNAs. Lastly, given that many factors can regulate tDNA transcription and that tDNAs are not randomly distributed within the genome, we wanted to assess whether their organization within the genome may impact their transcriptional activity. To investigate this, we first characterized the localization of tDNAs in the latest human genome assembly (T2T-CHM13), identifying patterns of tDNA clustering. We then determined that these clusters are associated with increased transcriptional activity. Building on these findings, we explored whether the transcriptional activity of tDNAs also influences their susceptibility to somatic mutagenesis. Our analysis revealed that tDNAs are exceptionally prone to accumulate somatic mutations, with mutation rates up to nine-fold higher than those of protein-coding genes. Moreover, mutation rate at tDNAs increased with transcriptional activity, and mutational loads were tumor-type and age-dependent. The analysis of mutational signatures identified APOBEC3 activity as the main

contributor to tDNA somatic mutagenesis. Notably, Mutations at structurally conserved tRNA positions appear to be under negative selection, preventing mutation accumulation at these critical sites. By contrast, other positions were hypermutated, which could disrupt tRNA biogenesis and impair tRNA function, potentially contributing to cellular dysfunction. We propose that the accumulation of somatic mutagenesis at tDNAs could cause proteome heterogeneity and compromise proteostasis, factors that could contribute both to tissue aging and to the development or progression of cancer

[cat] Els ARN de transferència (tRNAs) tenen un paper fonamental en la síntesi de proteïnes. Descodifiquen l’ARN missatger en aminoàcids mitjançant les interaccions codó-anticodó, en base el codi genètic. El conjunt de tRNAs cel·lulars estan determinats principalment per la transcripció dels gens de tRNA (tDNAs), controlada per diversos mecanismes reguladors. A més de ser transcrits, per ser completament actius, els tRNA experimenten un processament post-transcripcional, incloent l’addició de modificacions químiques. Alteracions en la biogènesi dels tRNAs s’han associat amb malalties com el càncer i trastorns neurològics. Degut a la complexitat de la seva biologia, la caracterització del repertori cel·lular de tRNAs sovint comporta reptes metodològics. En conseqüència, la biologia dels tRNA presenta encara múltiples incògnites que cal resoldre mitjançant estudis més detallats per entendre la seva participació en els mecanismes moleculars de les malalties. Per aquest motiu, en aquesta tesi, ens centrem en l'aplicació i el desenvolupament d’estratègies bioinformàtiques per desxifrar diferents aspectes de la biologia dels tRNAs. Actualment, una de les tècniques més utilitzades per l’anàlisis de tRNAs es la seqüenciació d’ARN petit (tRNA-Seq). Tanmateix, l'anàlisi de dades de tRNA-Seq requereix l'adaptació de procediments computacionals estàndard. Per aquest motiu, primer vam desenvolupar tRNAstudio, una pipeline integrativa que inclou una estratègia de mapatge que permet la caracterització del processament i la identificació de modificacions de tRNA, així com la implementació de l'anàlisi d'expressió diferencial de tRNAs. Tots els components es van integrar en una interfície gràfica d'usuari (GUI) que facilita l'anàlisi de dades de tRNA-Seq per a usuaris no computacionals. A continuació, ens vam centrar en la rellevància funcional de la modificació d'adenina (A) a inosina (I) a la posició 34 dels anticodons de tRNA (I34-tRNAs). Una modificació crucial per a l'expansió de la capacitat de descodificació dels tRNAs. En Eukarya, aquesta modificació està catalitzada per l'adenosina desaminasa específica per tRNA (ADAT), composta per ADAT2 i ADAT3. Les mutacions en els gens que codifiquen per ADAT s'han relacionat amb trastorns neurològics. Per comprendre l'impacte dels canvis en els nivells d'I34-tRNAs, el nostre grup va generar un model de d'ADAT2 knockdown (KD). Utilitzant tRNAstudio, vam analitzar l'impacte de l'ADAT2 KD en el conjunt de tRNAs. Els resultats van validar el model verificant una reducció dels I34-tRNAs. A més, vam observar que la cèl·lula no pot compensar la pèrdua regulant l'expressió de tRNAs alternatius, destacant el paper crític dels I34-tRNAs. Finalment, considerant que molts factors poden regular la transcripció dels tDNAs i que els tDNAs no es distribueixen aleatòriament dins del genoma, vam voler avaluar si la seva organització dins del genoma pot afectar la seva activitat transcripcional. Per examinar aquesta qüestió, primer vam caracteritzar la localització dels tDNAs en el darrer assemblatge del genoma humà (T2T-CHM13), identificant clústers de tDNAs. Després vam determinar que aquests clústers estan associats amb una major activitat transcripcional. A partir d'aquestes troballes, vam explorar si l'activitat transcripcional dels tDNAs també influeix en la seva susceptibilitat a la mutagènesi somàtica. Els resultats van revelar que els tRNAs són excepcionalment propensos a acumular mutacions somàtiques, amb taxes de mutació fins a nou vegades superiors a les dels gens que codifiquen per a proteïnes. A més, les taxes de mutació

dels tRNAs augmenten amb l'activitat transcripcional, i els nivells de mutació depenen del tipus tumoral i de l'edat. L'anàlisi de les signatures mutacionals va identificar l'activitat d'APOBEC3 com el principal contribuent a la mutagènesi somàtica dels tDNAs. Cal destacar que les mutacions en posicions estructuralment conservades semblen estar sota selecció negativa. En canvi, altres posicions estan hipermutades, cosa que podria afectar la funció dels tRNAs, contribuint potencialment a alteracions en la síntesi de proteïnes. Proposem que l'acumulació de mutagènesi somàtica als tDNAs podria causar heterogeneïtat del proteoma i comprometre la proteòstasi, factors que podrien contribuir tant a l’envelliment dels teixits com al desenvolupament o la progressió del càncer.